МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 2, с. 342-350
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 578.74
Светлой памяти Николая Вениаминовича Каверина посвящается
ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕН В МАЛОЙ СУБЪЕДИНИЦЕ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ Н5Ш НА СЕЛЕКЦИЮ МУТАНТОВ, РЕЗИСТЕНТНЫХ К НЕЙТРАЛИЗУЮЩИМ МОНОКЛОНАЛЬНЫМ АНТИТЕЛАМ
© 2015 г. А. В. Игнатьева1*, Т. А. Тимофеева1, И. А. Руднева1, А. А. Шилов1, О. В. Масалова1,
Р. Р. Климова1, А. А. Кущ1, Н. А. Ильюшина2, Н. В. Каверин1
Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России,
Москва, 123098 Россия
2Center for Drug Evaluation and Research, Food and Drug Administration USA, 20993, Silver Spring, USA
Поступила в редакцию 09.10.2014 г. Принята к печати 28.10.2014 г.
Изменения в устойчивости к физическим и химическим факторам у гемагглютинина (НА) вируса гриппа могут играть важную роль для селекции вариантов этих вирусов при циркуляции в естественных условиях. Нами исследованы эскейп-мутанты вируса гриппа A/mallard/Pennsylvama/10218/84 (H5N2), селекционированные моноклональным антителом, специфичным к эпитопу большой субъединицы HA (HA1). В результате селекции отобраны эскейп-мутант m4F11(4) с единичной аминокислотной заменой в HA1 (S145P1), а также вирусы m4G10(10) и m4G10(6) с дополнительными мутациями, идентифицированными в малой (HA2) субъединице HA: L124F2 и L124F2 + N79D2 соответственно. В эскейп-мутантах с заменами в HA2 компенсировано негативное действие мутации S145P1, что выражается в увеличении репродуктивной активности вирусов m4G10(10) и m4G10(6) на ранних стадиях инфекции в куриных эмбрионах и повышении термостабильности НА по сравнению с эскейп-мутантом m4F11(4). Вариации фенотипических свойств, обеспечивающих вирусу преимущества в процессе репликации, могут играть роль селективного фактора с последующим закреплением в популяции.
Ключевые слова: вирус гриппа А, гемагглютинин Н5, эскейп-мутанты, моноклональные антитела, фе-нотипические характеристики.
EFFECT OF AMINO ACID SUBSTITUTIONS IN SMALL SUBUNIT OF AVIAN H5N2 INFLUENZA VIRUS HEMAGGLUTININ ON SELECTION OF THE MUTANTS RESISTANT TO NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES, by A. V. Ignatieva1*, T. A. Timofeeva1, I. A. Rudneva1, A. A. Shilov1, O. V. Masalova1, R. R. Klimova1, A. A. Kushch1, N. A. Ilyushina2, |N. V. KaverinI1 (1Ivanovsky Institute of Virology, Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, 123098 Russia,*e-mail: valgella@yandex.ru; 2Center for Drug Evaluation and Research, Food and Drug Administration USA, 20993, Silver Spring, USA). Changes associated with the resistance to physical and chemical factors in the hemagglutinin (HA) of influenza A viruses may play an important role in the selection of different influenza variants during circulation in nature. Here, we studied the escape mutants of influenza virus A/mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2) that were selected by the monoclonal antibody. The escape mutant m4F11(4) carried a single amino acid substitution in large subunit (HA1) of the HA, S145Pj, and two ones, m4G10(10) and m4G10(6), had additional amino acid changes in the small subunit (HA2), namely: L124F2 and L124F2 + N79D2, respectively. As it has been found the substitutions appeared in the HA2 of m4G(10) and m4G(6) viruses compensated negative effect of the S145Pj mutation and provided a significant increase in the viral replication ability at the early stage of infection in embryonated chicken eggs as well as in HA thermostability in comparison with m4F11(4) mutant. Phenotypic properties that provide advantages in the process of virus replication can play a role of the positive selection factor in viral population.
Keywords: influenza A virus, hemagglutinin H5, escape mutants, monoclonal antibodies, phenotypic properties. DOI: 10.7868/S0026898415020044
* Эл. почта: valgella@yandex.ru
Антигеный дрейф поверхностных гликопроте-инов гемагглютинина (НА) и нейраминидазы — один из важнейших механизмов эволюции вируса гриппа А человека. Сходное явление описано для вирусов гриппа птиц подтипа Н5№, вызывающего эпизоотии у птиц и спорадические случаи тяжелого заболевания среди людей [1, 2]. В настоящее время для моделирования антигенного дрейфа используют селекцию эскейп-мутантов, резистентных к нейтрализующему действию моноклональ-ного антитела (монАТ). Помимо аминокислотных замен в большой субъединице (НА1), ответственных за устойчивость к нейтрализующему действию монАТ, в эскейп-мутантах могут появляться аминокислотные замены в участках НА, которые не взаимодействуют с монАТ Обычно такие замены считают случайными, а их появление у эскейп-му-тантов рассматривают как результат высокой частоты мутаций у вирусов гриппа.
В предыдущих работах в ходе антигенного картирования НА подтипа Н5 нами охарактеризован большой набор эскейп-мутантов [3, 4]. Многие мутанты, полученные посредством однократной селекции, несли две или три аминокислотные замены, причем некоторые из них были расположены в малой субъединице (НА2), которая не взаимодействует с монАТ, использованными при селекции [4]. В тех случаях, когда одну и ту же замену в НА2 выявляли у мутантов, полученных в независимых экспериментах селекции конкретным монАТ, случайность таких событий считалась маловероятной. В данной работе изучено влияние аминокислотных замен в НА2 на фено-типические характеристики эскейп-мутантов вируса гриппа подтипа Н5.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Вирусы. Вирус А/таПагё/Репп5у]уаша/10218/84 (Н5№) (Мкё/РА-МА), адаптированный к мышам в лаборатории субвирусных структур ФГБУ НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского Минздрава России [5], использовали для селекции эскейп-мутантов m4F11(4) и m4G10(10) [4, 6]. Вирусы накапливали в 10-дневных куриных эмбрионах, которые заражали в аллантоисную полость вируссодер-жащим материалом с множественностью инфекции 1000 ЭИД50 на эмбрион. Зараженные куриные эмбрионы инкубировали в течение 48 ч при 37°С, после чего охлаждали в течение ночи при 4°С. Ви-руссодержащую аллантоисную жидкость собирали, определяли в ней содержание вируса титрованием в реакции гемагглютинации (РГА) [7], выражая титр вируса как число гемагглютинирующих единиц (ГАЕ). Препараты хранили при —80°С.
Моноклональные антитела. Антитела 3G9, 4G10, 4F11, 5F12, 6Е2, 5G9 и 7Е11 против НА вируса гриппа А/ёиск/Моуо81Ыг8к/56/05 (Н5№) использовали в виде асцитной жидкости мышей [8, 9].
Селекция эскейп-мутантов. Получение эскейп-мутантов вируса гриппа проводили по методике Вебстера и Лейвера (Webster & Laver) [10] с некоторыми модификациями. Аллантоисную жидкость, разведенную до концентрации инфекционного вируса 2 х 107 ЭИД50/мл, смешивали с монАТ и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Полученной суспензией заражали 10-дневные куриные эмбрионы и инкубировали при 37°С в течение 48 ч. В реакции торможения гемагглютинации (РТГА) [11] отбирали варианты, устойчивые к данному монАТ, и проводили 5— 6-кратное клонирование в куриных эмбрионах методом предельных разведений с целью получения однородной вирусной популяции.
Определение инфекционности вирусов гриппа на куриных эмбрионах. Для определения 50%-ной эмбриональной инфекционной дозы (ЭИД50) 10-дневные куриные эмбрионы заражали в аллантоисную полость 10-кратными серийными разведениями вируса — по 5 эмбрионов на разведение. Зараженные куриные эмбрионы инкубировали 48 ч при 37°С, охлаждали в течение ночи, после чего в аллантоисной жидкости, собранной из каждого эмбриона, оценивали наличие вируса, используя метод РГА с 0.75%-ными куриными эритроцитами. Среднее значение ЭИД50 для каждого вируса вычисляли, пользуясь методом Рида и Мен-ча (Reed & Muench) [12].
Очистка и концентрирование вирусов гриппа. Ви-
руссодержащую аллантоисную жидкость после центрифугирования (3000 об./мин, 15 мин, 4°C) наслаивали на 4 мл 20%-ной сахарозы в буфере 0.01 M Трис-HCl (pH 7.2), содержащем 0.15 М NaCl, и осаждали вирус ультрацентрифугированием ("Beckman", США) в роторе SW-27 при 22000 об./мин в течение 90 мин при 4°C. Вирус ресуспендировали в гомогенизаторе Даунса в том же буфере, в 1/64 исходного объема, и осветляли центрифугированием (3500 об./мин, 8 мин, 4°C). Содержание вируса в полученных препаратах определяли титрованием в РГА; образцы хранили при —80°C.
Серологические реакции. Твердофазный имму-ноферментный анализ (ТФИФА) проводили в варианте Филпотта (Philpott) и др. [13] c некоторыми модификациями. В каждую лунку 96-лу-ночного планшета вносили препарат очищенного вируса, разведенный до 100 ГАЕ в PBS (pH 7.4), и инкубировали при 4°С в течение 18 ч. Не связавшийся с планшетом вирус удаляли промывкой PBS с 0.05% Твин-20 (PBST), блокировали свободные участки поверхности 2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS в течение 1ч при 37°С. После удаления блокировочного раствора в лунки вносили монАТ, разведенные PBS с 1% БСА, инкубировали 2 ч при 37°C, тщательно промывали PBST и проводили связывание с антимышиными козьими антителами,
конъюгированными с пероксидазой хрена ("Sigma Chemical Co.", США). В промытые лунки вносили по 100 мкл раствора тетраметилбензидина в субстратном буфере ("МДЛ", Россия). Реакцию останавливали 2М H2SO4 и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре Microplate Reader ("BioRad", США) при длине волны 450 нм. Эффективность связывания монАТ с вирусом оценивали по формуле Филпотта (Philpott) и др. [13].
РТГА проводили по общепринятому методу [11] с использованием 0.75%-ной суспензии куриных эритроцитов.
Кинетика накопления вирусов в куриных эмбрионах. Репликативную кинетику вирусов в куриных эмбрионах исследовали (как описано нами ранее [6]) в присутствие и в отсутствии монАТ 4G10, полученного к вирусу A/duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1). Вируссодержащей аллантоисной жидкостью (1000 ЭИД50) заражали 10-дневные куриные эмбрионы (по 5 эмбрионов на каждый временной интервал) и инкубировали при 37°С в течение 18, 24, 36 или 48 ч. По истечении каждого временного интервала эмбрионы охлаждали, отбирали алланто-исную жидкость и в каждом образце определяли содержание вируса методом РГА.
Для определения кинетики н
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.