ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2009, том 56, № 1, с. 67-77
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
СВОБОДНАЯ ГАЛАКТОЗА И ГАЛАКТОЗИДАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ В ВОЛОКНАХ ЛЬНА НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ИХ ФОРМИРОВАНИЯ
© 2009 г. П. В. Микшина, С. Б. Чемикосова, Н. Е. Мокшина, Н. Н. Ибрагимова, Т. А. Горшкова
Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук, Казань
Поступила в редакцию 22.02.2008 г.
Проведен анализ состава и содержания свободных моносахаридов и активности в-галактозидазы в тканях льна (Linum usitatissimum L.), содержащих флоэмные волокна на разных стадиях формирования. В участках стебля, содержащих волокна на стадии формирования вторичной клеточной стенки "желатинозного" типа выявлено значительное содержание свободной галактозы (14 мМ), многократно в 13-20 раз превосходящее этот показатель для верхней части стебля, где волокна находятся на стадии интрузивного роста. С помощью pulse-chase экспериментов выявлены различия в характере метаболизма отдельных низкомолекулярных сахаров. Для глюкозы и сахарозы все проанализированные показатели (содержание, абсолютная и удельная радиоактивность, их динамика) были сопоставимы в участках стебля, содержащих волокна на разных стадиях развития. Меченую галактозу обнаруживали только в участках стебля, содержащих волокна на стадии формирования вторичной клеточной стенки. Удельная радиоактивность глюкозы и сахарозы была максимальна сразу после фотосинтеза в присутствии 14С02, характер ее динамики совпадал с этим показателем для первичных продуктов фотосинтеза. Динамика включения метки в галактозу указывала на то, что этот моносахарид появляется в результате гидролитических процессов. На стадии формирования вторичной клеточной стенки выявлена высокая активность в-галактозидазы, субстратом для которой может служить ткане- и стадия-специфичный в-1,4-галактан волокон.
Ключевые слова: Linum usitatissimum - флоэмные волокна - клеточная стенка "желатинозного типа" -свободные моносахариды - галактоза - галактан - в-галактозидаза.
ВВЕДЕНИЕ
Флоэмные волокна льна формируют вторичную клеточную стенку особого, так называемого "желатинозного", типа [1]. Этот тип клеточной стенки встречается у многих растительных волокон и отличается аксиальным расположением микрофибрилл целлюлозы и почти полным отсутствием ксилана и лигнина - характерных полимеров вторичной клеточной стенки наиболее известного ксиланового типа. Процессы, протекающие при формировании клеточной стенки "желатинозного" типа, исследованы мало, хотя их изучение могло бы способствовать пониманию механизмов ориентации микрофибрилл, характера взаимодействия полисахаридов при создании надмолекулярной структуры клеточной стенки, а также особенностей метаболизма клеток, ориентированных на интенсивный синтез целлюлозы. Дополнительным аргументом для изучения формирования клеточных стенок "желатинозного" типа служит то, что они широко представлены у лубо-во-локнистых культур и в древесине напряжения - растительном сырье для многоцелевого использования.
Адрес для корреспонденции: Горшкова Татьяна Анатольевна. 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31, а/я 30. Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН. Электронная почта: gorshkova@mail.knc.ru
Известно, что при образовании клеточной стенки "желатинозного" типа в волокнах льна присутствует ткане- и стадия-специфичный в-1,4-галактан [2, 3]. С помощью ряда прямых и косвенных аргументов установлено, что этот полимер синтезируется в высокомолекулярной (2000 кД) форме, а в клеточной стенке обнаруживается во фракции с мол. м. 100-400 кД [1, 4]. Постсинтетическая модификация галактана может заключаться в отщеплении части галактозных цепочек, что должно сопровождаться появлением моно- или олигомерных форм галактозы. Для проверки этого предположения мы сопоставили состав и содержание свободных моносахаридов, а также активность в-галактозидазы в тканях, содержащих флоэмные волокна на разных стадиях формирования. Характер метаболизма отдельных моносахаридов анализировали в pulse-chase экспериментах с интактными растениями.
МЕТОДИКА
Растительный материал. Объектом исследований служили растения льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) сорта Новоторжский из коллекции ВНИИ льна (Торжок). Растения выращивали в условиях вегетационного опыта в ящиках со слоем почвы 50 см, на открытом воздухе при естественной освещенно-
67
5*
JC
1»
1"
л*
i
40 мин 4 ч 8 ч 1 сутки 2 суток 5 суток 10 суток
Рис. 1. Схема отбора растительного материала для анализа содержания и радиоактивности моносахаридов осветленного гомогената.
• - "точка слома"; а - участок стебля, содержащий волокна на стадии интрузивного роста; б - участок стебля, разделяемый на внешнюю, содержащую волокна на стадии формирования вторичной клеточной стенки, и внутреннюю (ксилемную) части.
сти и ежедневном поливе. Эксперимент начинали на стадии быстрого роста растений; средняя высота растения в этот период составляла 22 ± 2 см (27 дней после посева).
При фиксации растительного материала в качестве ориентира было выбрано положение на стебле "точки слома", которая служит маркером перехода волокон от стадии удлинения к стадии формирования вторичной клеточной стенки [5, 6]. Схема отбора проб представлена на рис. 1. В начале эксперимента находили "точку слома", измеряли расстояние от нее до семядолей (15 см) и фиксировали 10-сантиметровые участки стебля ниже "точки слома" (рис. 1, участок "б"). На следующих этапах эксперимента фиксировали участки стебля на этой же высоте, что позволяло отслеживать последовательные этапы утолщения клеточной стенки волокон [5]. Для анализа использовали внешнюю (волокнистую) часть стебля, которую отделяли перед фиксацией от внутренней (ксилемной) части. Участки стебля, содержащие интрузивно растущие волокна (участок "а"), отбирали выше соответствующей "точки слома" в каждой временной точке. Длина верхней части стебля до "точки слома" составляла 7.0 ± 0.2 см. Перед фиксацией верхней части стебля во всех экспериментах удаляли два верхних сантиметра, содержащие апекс и зону растяжения, таким образом, длина зафиксированного верхнего участка стебля составляла 5 см.
Зафиксированный растительный материал использовали для определения состава, содержания и радиоактивности низкомолекулярных сахаров. Количество биологических повторностей в опыте - 3.
Каждая биологическая повторность (проба) включала либо три верхних участка "а" стебля (280300 мг сырой массы), либо три волокнистых (150250 мг сырой массы), либо три ксилемных части стебля (200 мг сырой массы), отобранных с участка "б" (рис. 1).
При оценке Р-галактозидазной активности в участках стебля каждая проба состояла из 25 5-сантиметровых верхних участков стебля (3 г сырой массы) или 25 5-сантиметровых участков ниже "точки слома" (3 г сырой массы) без разделения на волокнистую и ксилемную части.
Отдельно фиксировали волокнистые части 10-сантиметровых участков ниже "точки слома" (4 г сырой массы) для выделения тканеспецифичного галактана.
Получение осветленных гомогенатов, фракции полимеров, содержащей тканеспецифичный галак-тан, и препарата галактана. Осветленные гомогена-ты для определения состава, содержания и радиоактивности низкомолекулярных сахаров получали, гомогенизируя пробы в жидком азоте в 3 мл 50 мМ К-фосфатного буфера (рН 7.0). Гомогенат центрифугировали в течение 5 мин при 8000 g и фильтровали. Для моносахаридного анализа отбирали 20 мкл осветленного гомогената.
Для оценки Р-галактозидазной активности пробы растительного материала гомогенизировали в жидком азоте в 30 мл 10 мМ Na-ацетатного буфера (рН 5.5). Гомогенат осветляли центрифугированием при 8000 g в течение 20 мин.
Для осаждения полимеров, в том числе тканеспецифичного галактана, в осветленный гомогенат добавляли 96% этанол до конечной концентрации 80%. Полученный осадок отделяли центрифугированием при 8000 g в течение 10 мин. Фракцию полимеров, содержащую тканеспецифичный галактан (водоэкстрагируемая фракция полимеров), экстрагировали из осадка 1 мл 10 мМ Na-ацетатного буфера (рН 5.5).
Растительный материал (4 г) для получения препарата галактана обрабатывали по аналогичной схеме. Затем водоэкстрагируемую фракцию полимеров разделяли на колонке (0.9 х 90 см) с се-фарозой CL-4B ("Pharmacia", Швеция) при 8°С. Фракции, содержащие высокомолекулярный галактан (900-2000 кД), объединяли. Рехроматогра-фирование высокомолекулярного пика при анализе действия фермента проводили при тех же условиях через 5 или 48 ч выдерживания препарата при 8°С. Для определения содержания сахаров во фракциях использовали фенольный метод определения моносахаридов Dubois с соавт. [7].
Pulse-chase эксперименты проводили при исследовании метаболизма тканеспецифичного галактана волокон льна. Многоплановая информация, полученная в этих обширных экспериментах, в настоящее время анализируется; в данной работе
а
а
представлена лишь та ее часть, которая позволяет выявить характер метаболизма отдельных моносахаридов.
Для введения 14С02 в растения использовали замкнутую фотосинтетическую систему, общий объем которой составлял 90 л. Растущие в почве растения льна целиком помещали в фотосинтетическую камеру. Внесение 370 МБк NaH14CO3 не приводило к существенному отклонению концентрации С02 от естественной. Время экспозиции растений с меченым субстратом составляло 40 мин, убыль радиоактивности за время экспозиции не превышала 30%. Продолжительность экспозиции с 14CO2 была выбрана с учетом необходимости попадания метки в различные пулы, в том числе в полисахариды клеточной стенки. Опыт проводили при естественном освещении в безоблачный день; температура в фотосинтетической камере составляла 26°С. Часть растений фиксировали жидким азотом сразу после экспозиции с 14С02, остальные - через 4 и 8 ч, 1, 2, 5 и 10 суток роста растений в естественных условиях.
Моносахаридный анализ проводили с помощью метода высокоэффективной анионообменной хроматографии (НРАЕС) на колонке (4 х 250 мм) Car-boPac PA-1 ("Dionex", США), используя импульсный амперометрический детектор PAD ("Dionex"). Скорость элюирования 1 мл/мин. Т
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.