КОЛЛОИДНЫЙ ЖУРНАЛ, 2013, том 75, № 1, с. 9-16
УДК 577.334:544.723.2
СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ СШИВАНИЕ МОЛЕКУЛ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА НА ПОВЕРХНОСТИ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА
В ВОДНОЙ ДИСПЕРСИИ
© 2013 г. А. В. Бычкова, М. А. Розенфельд, В. Б. Леонова, О. Н. Сорокина,
С. М. Ломакин, А. Л. Коварский
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН 119334 Москва, ул. Косыгина, 4 Поступила в редакцию 24.02.2012 г.
Разработан принципиально новый универсальный подход к сшиванию белковых макромолекул на поверхности наночастиц магнетита. В основе подхода лежит способность белков подвергаться сво-боднорадикальной модификации с образованием межмолекулярных ковалентных сшивок. Генерация свободных радикалов происходит локально на поверхности наночастиц. Создано устойчивое белковое покрытие из сывороточного альбумина толщиной 3 нм на поверхности наночастиц магнетита. Совокупностью физико-химических методов доказано, что устойчивое покрытие из макромолекул белков формируется вокруг индивидуальных наночастиц. Реакционноспособные группы, входящие в структуру белков, позволяют проводить дальнейшую модификацию поверхностного слоя, в том числе, осуществлять прививку небелковых лекарственных препаратов. Разработанный подход может быть использован при создании высокодисперсных систем с заданными свойствами поверхности для векторной доставки лекарственных и биологически активных веществ.
Б01: 10.7868/80023291213010047
ВВЕДЕНИЕ
Магнитные наночастицы (МНЧ) находят все более широкое применение в различных областях науки и техники. Особый интерес вызывает их использование в биологии и медицине, например, для гипертермии, магнитно-резонансных исследований, иммунологического анализа, очистки биологических жидкостей, клеточной и молекулярной сепарации, тканевой инженерии [1—10]. Одним из перспективных направлений является конструирование магнитоуправляемых наноси-стем (МНС) для векторной доставки лекарственных препаратов к клеткам-мишеням. В качестве магнитных ядер широко применяют наночастицы оксидов железа (маггемита и магнетита), которые совмещают в себе хорошую магнитоуправ-ляемость и возможность модификации поверхности. Традиционно в состав МНС входят биологические или синтетические молекулы, которые служат основой для полифункциональных покрытий на поверхности МНЧ. К покрытиям предъявляется целый ряд требований. Они должны:
♦ обладать биосовместимостью и тромборези-стентностью;
♦ иметь в своем составе биовекторы для нацеливания или узнавания биологических систем (органов, тканей, клеток и их составляющих) и терапевтические препараты (лекарства или гены);
♦ обеспечивать возможность локализации МНС в биологических мишенях;
♦ предотвращать процессы агломерирования МНС в дисперсии;
♦ защищать магнитные ядра МНС от воздействия биологической среды при попадании в организм;
♦ быть закреплены на поверхности наночастиц.
Покрытия на основе природных белковых макромолекул представляются наиболее перспективными для биомедицинских целей, поскольку в наибольшей степени удовлетворяют вышеперечисленным требованиям. При использовании белков в качестве покрытий важно максимально сохранить их активность [11]. Закрепление покрытий на поверхности МНЧ представляет непростую задачу. Традиционно белковые покрытия закрепляют на поверхности МНЧ с помощью бифункциональных сшивателей, например карбодиими-да [12, 13] или глутарового альдегида [14, 15]. В работе [14] прибегали к предварительной модификации поверхности МНЧ магнетита аминоси-ланами и впоследствии с помощью глутарового альдегида прикрепляли к ним молекулы белков. Авторы исследования [15] адсорбировали бычий сывороточный альбумин (БСА) на поверхности МНЧ в присутствии карбодиимида. Однако результаты работы свидетельствуют о десорбции
белковых молекул с поверхности МНЧ и неизбирательном сшивании макромолекул белка, проявляющемся в сшивании макромолекул в растворе. Кроме того, закрепление молекул белка на поверхности МНЧ с помощью бифункциональных сшивателей может сопровождаться нежелательным образованием полидисперсного ансамбля частиц в результате сшивания молекул белка, принадлежащих разным наночастицам. В этой связи использование традиционных сшивателей для создания устойчивых белковых покрытий на МНЧ для биомедицинских целей представляется малоперспективным.
Известно, что белки обладают способностью вовлекаться в процесс свободнорадикального окисления и образовывать межмолекулярные сшивки в присутствии свободных радикалов [16]. Цель настоящей работы заключалась в создании покрытия из сывороточного альбумина на поверхности индивидуальных наночастиц магнетита с использованием принципиально нового способа свободнорадикального сшивания белков.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Синтез магнитных наночастиц
Магнитные наночастицы магнетита — смешанного оксида состава FeO • Fe2O3 — синтезировали путем соосаждения солей двух- и трехвалентного железа при 4°C в водной среде в присутствии гидроксида аммония:
Fe2+ + 2Fe3+ + 8OH- ^ Fe3O4^ (магнетит) + 4H2O.
Соли железа FeSO4 • 7H2O и FeCl3 • 6H2O (обе — фирмы Вектон, Россия) растворяли в количестве 1.42 г и 2.40 г соответственно в 50 мл дистиллированной воды, так что мольное соотношение Fe2+ : Fe3+ составляло 1 : 2, и фильтровали. Затем к раствору солей добавляли 2.40 г ПЭГ с молекулярной массой 2 кДа (Ferak Berlin GmbH, Германия). К раствору солей, содержащему ПЭГ и охлажденному до 4°C, добавляли 10 мл охлажденного до 4°C 25%-ного раствора NH4OH (Химмед, Россия) при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. После окрашивания раствора в черный цвет (магнетит) реакционную смесь помещали на магнит, выдерживали до выпадения черного магнитного осадка и сливали прозрачную надосадоч-ную жидкость, заменяя ее дистиллированной водой. Процедуру "промывания" магнитного осадка многократно повторяли до получения нейтральных значений pH. Магнитные наночастицы стабилизировали путем создания двойного электрического слоя (ДЭС). ДЭС формировался в резульлтате добавления 30 мл 0.1 М фосфат-цитратного буфера (0.05 М NaCl) с pH 4.0 к магнитному осадку в условиях диспергирования с использованием ультразвукового генератора
МЭФ 314 (ООО Мелфиз-ультразвук, Россия). Концентрация наночастиц в полученном гидрозоле, определенная путем взвешивания после высушивания известного объема дисперсии с поправкой на массу солей в буферном растворе, составляла 37 мг/мл.
Получение белковых покрытий
Для получения альбуминовых покрытий на поверхности МНЧ использовали реакционные системы, включающие 2.80 мл раствора коммерческого препарата БСА (Sigma-Aldrich, США) с концентрацией 2 мг/мл (образец БСА2-МНЧ-1) или 1 мг/мл (образец БСА1-МНЧ-1) в 0.05 М фосфатном буфере с pH 6.5, 50 мкл 3%-ного пе-роксида водорода и 0.35 мл гидрозоля магнетита. Пероксид водорода вступает в реакцию с имеющимися на поверхности наночастиц магнетита ионами двухвалентного железа и происходит генерация гидроксил-радикалов (реакция Фентона):
Fe2+ + H2O2 ^ Fe3+ + OH' + OH-.
Контрольные образцы БСА2-МНЧ-0 и БСА1-МНЧ-0 отличались от соответствующих опытных образцов отсутствием в реакционной системе пе-роксида водорода, вместо которого было добавлено эквивалентное количество дистиллированной воды. Контрольный образец БСА2-МНЧ-2 был получен по методике, аналогичной используемой при получении образца БСА2-МНЧ-1, но отличался от него тем, что в реакционную систему дополнительно вводили 0.01 мл раствора аскорбиновой кислоты с концентрацией 152 мг/мл для генерации свободных радикалов в объеме реакционной системы. Известно, что аскорбиновая кислота вступает в реакцию с пероксидом водорода с образованием гидроксил-радикала [17].
Исследование адсорбции макромолекул на магнитных наночастицах
Размеры как синтезированных МНЧ, так и МНЧ с белковым покрытием оценивали методом динамического рассеяния света на спектрометре Zetasizer Nano-S (Malvern, Англия) с углом детектирования 173° при температуре 25°C. Количественные данные по адсорбции макромолекул БСА на МНЧ получали с помощью ЭПР-спек-троскопии спиновых меток [18]. Ковалентное связывание стабильных нитроксильных радикалов с макромолекулами белков осуществлялось по реакции:
К 1 мл раствора БСА с концентрацией 1 мг/мл добавляли 25 мкл раствора нитроксильного радикала с концентрацией 2.57 мг/мл и инкубировали в течение 6 ч. После инкубации проводили диализ раствора против буферного. В среднем, одна привитая спиновая метка приходилась на 4—5 макромолекул БСА. Концентрацию спиновых меток определяли методом двойного интегрирования спектров ЭПР радикалов в растворе белка до и после диализа. Времена корреляции вычисляли с использованием компьютерных программ. Спектры электронного магнитного резонанса (ЭМР) регистрировали на спектрометре Вгакег ЕМХ 2.7/8 (Германия) в Х-диапазоне при температуре 25 ± 0.5°С. Мощность СВЧ-излучения составляла 5 мВт, амплитуда модуляции — 1 Гс. В качестве внешнего стандарта при регистрации спектров нитроксильных радикалов использовали порошок оксида магния, содержащий ионы Мп2+.
Контроль устойчивости белкового покрытия и избирательности свободнорадикального сшивания
Устойчивость белкового покрытия оценивали по возможности конкурентного замещения молекул БСА фибриногеном (ФГ), который, как было показано ранее, проявляет высокую склонность к физической адсорбции на поверхности частиц магнетита [19]. Методами ЭПР-спектроскопии спиновых меток и ферромагнитного резонанса (ФМР) был проанализирован конкурентный адсорбционный процесс в реакционной системе, содержащей макромолекулы БСА, коммерческий препарат ФГ ^1§та-АЫг1сИ, США) и наночасти-цы магнетита. К образцу БСА1-МНЧ-0 объемом 1 мл, инкубированному в течение 1.5 ч до достижения адсорбционного равновесия, добавляли 250 мкл раствора ФГ концентрации 3 мг/мл в фосфатном буфере с рН 6.5.
Методом динамического рассеяния света регистрировали изменение размеров частиц в образцах БСА1-МНЧ-0, БСА2-МНЧ-0, БСА1-МНЧ-1, БСА2-МНЧ-1 и БСА2-МНЧ-2 при добавлении к 1.0 мл образцов 0.25 мл раствора ФГ концентрации 4 мг/мл в 0.05 М фосфатном буфере при рН 6.5.
Устойчивость белковых покрытий на наноча-стицах в образцах Б
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.