РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2014, том 54, № 3, с. 305-308
= КЛЕТОЧНАЯ РАДИОБИОЛОГИЯ =
УДК [57+61]::539.1.04:34.17.19:595.426:595.775.1
СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ ПРИ у-ОБЛУЧЕНИИ ДАФНИЙ
in vivo В МАЛЫХ ДОЗАХ
© 2014 г. Е. И. Сарапульцева1, *, О. П. Мелехова2, Г. В. Коссова2, Ю. В. Иголкина1, Н. В. Алексеева2
1Обнинский институт атомной энергетики Национального исследовательского ядерного университета "МИФИ",
Обнинск
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва
Для изучения механизмов низкодозового радиационного воздействия на ракообразных рода Daph-nia применен радиоиндикаторный метод привитой сополимеризации. Метод основан на количественной радиометрической регистрации процесса полимеризации, развивающегося в клетках многоклеточного организма под действием свободных радикалов, пропорционально имеющимся в тканях их количеству. Обнаружено, что воздействие у-излучения в дозах 100 и 1000 мГр повышает количественный уровень свободно-радикальных реакций у непосредственно облученных дафний и первого поколения молоди, полученного от облученных самок. Это коррелирует со снижением жизнеспособности дафний и может быть его причиной.
у-Излучение, малые дозы, свободные радикалы, дафнии, трансгенерация. DOI: 10.7868/S0869803114030138
Одним из механизмов действия ионизирующей радиации в малых дозах на клетки является образование в них избыточного количества активных форм кислорода и, как следствие, пере-кисное окисление липидов клеточных мембран [1, 2]. Концентрация свободных радикалов (СР) в клетках и организме характеризует количественный уровень окислительно-восстановительных реакций, так как СР являются промежуточными продуктами последних. В ряде работ показано, что концентрация СР в тканях коррелирует с функциональной активностью организма и является весьма чувствительным показателям возможности разного рода повреждений клеток и тканей [3—6].
Целью работы был анализ количественного уровня свободных радикалов, образующихся под действием у-излучения в малых дозах у представителей многоклеточных гидробионтов рачков Daph-nia magna и у их потомства первого поколения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Размножение дафний в лабораторных условиях осуществляется путем партеногенеза [7], что обеспечивает генетическую однородность попу-
* Адресат для корреспонденции: 249040, Обнинск, Калужская обл., Студгородок, 1, ОИАТЭ НИЯУ МИФИ, кафедра биологии; тел.: 8 (48439) 3-11-79; факс: 8 (48439), 7-08-22; e-mail: helen-bio@yandex.ru.
ляций. Эмбриональный и постнатальный периоды длятся по 4—5 сут каждый, период созревания 8—10 сут, репродуктивный период в условиях лаборатории — до 2.5—3 мес. Полулетальная доза (LD50/30) для D. magna около 50 Гр [8, 9]. Дафнии в нашей лаборатории культивируются около 10 лет.
3—44-суточных рачков облучали в ФГБУ МРНЦ (г. Обнинск) на терапевтической установке "Луч-1" (60Co, Латвия) в дозах 100 мГр (17 сГр/мин) и 1000 мГр (100 сГр/мин) в пластиковых пробирках ("BD Falcon", Нидерланды) в объеме 15 мл воды по 20 особей. Контроль находился в тех же условиях, но не облучался. Через 5 ч после облучения начинали анализ количества свободно-радикальных реакций на оборудовании МГУ им. М.В. Ломоносова.
Для получения первого поколения 1-суточных дафний облучали в тех же дозах и культивировали по 5 особей в стеклянных лабораторных стаканах ("Лабтех", Москва) со 100 мл водопроводной дехлорированной отстоявшейся воды при оптимальной температуре 20 ± 2°С и постоянном освещении лампой дневного света. Кормление 1 раз в сутки суспензией водорослей Chlorella vulgaris из расчета 100 мкл (плотность 600—1000 млн клеток/мл) на 100 мл воды. Водоросли культивировали на среде Тамия [7, 10]. Из второго/третьего пометов каждой дозовой группы и контроля произвольно отбирали по 20 рачков в пластиковые пробирки ("BD Falcon", Ни-
6
305
я 6000
о ч
м 5000
4000
3000
2000
1000
Облученные родители
i
Необлученные потомки
0 100 1000 0 100 1000 Доза родительского облучения, мГр
1 мл 1.5 моль/л раствора Трис и по 10 мл сцинтил-ляционного раствора Брея.
Истинную радиоактивность полученных опытных и контрольных образцов измеряли методом жидкостной сцинтилляции, учитывая, что радиоактивность пропорциональна уровню радикальной полимеризации и, соответственно, уровню свободных радикалов, и выражали количеством (долей) распадов в минуту — ДРМ).
Проведено по три серии опытов для родительского и первого поколения дафний. Результаты обработаны статистически с использованием непараметрических критериев Крускала—Уоллиса и X2 [12].
0
Рис. 1. Уровень свободных радикалов (истинная радиоактивность, ДРМ) у тестируемых дафний в опыте и контроле у непосредственно облученных дафний-родителей (F0) и их необлученного потомства первого поколения (Fj).
дерланды), содержащие по 15 мл культуральной воды, и транспортировали в МГУ.
Анализ количества актов СР-реакций проводили радиоиндикаторным методом привитой радикальной сополимеризации in vivo [5, 11]. Суть метода заключается в том, что если в биологический объект, содержащий СР, ввести какой-либо мономер, способный к полимеризации под действием радикалов, то процесс полимеризации развивается пропорционально имеющемуся в тканях количеству СР. При введении в объект меченого мономера наличие реакционно-способных СР можно зарегистрировать по концентрации меченых сополимеров, т.е. радиоактивности образцов методом радиометрии. В качестве мономера в данной работе был использован меченный по углероду акриламид (14С-АА-) [11]. Активность рабочего раствора (14С-АА) — была 1 мкКи/мл при удельной активности препарата 100 мкКи/мл. Концентрация и активность меченого вещества составляла 0.01% 14С-АА-.
Дафний помещали по 20 особей в лунки 12-лу-ночного планшета ("SPL Lifesciences", Республика Корея) в 1 мл рабочего раствора акриламида на 1.5 ч. После инкубации дафний трижды отмывали в дистиллированной воде в пластиковых чашках Петри ("Nuova Aptaca", Италия), обсушивали на фильтровальной бумаге и помещали во флаконы для сцинцилляционного счета ("Sarstedt", Германия). К каждой пробе добавляли по 0.4 мл концентрированной HClO4 и ставили в термостат на 10—15 ч при температуре 56°С до полного растворения пробы. Затем к каждой пробе добавляли по
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 1 представлен количественный уровень радиоактивности, который пропорционален уровню инициируемой радикалами полимеризации 14С-меченного мономера, и соответственно количеству свободных радикалов у непосредственно облученных в малых дозах дафний F0 и у их первого необлученного поколения F1.
Проведенный анализ гомогенности измеряемых показателей в каждой из контрольных групп дафний родительского и 1-го поколения в разных повторах опытов показал отсутствие статистически достоверной разницы по тесту Крускала—Уоллиса (0.09 <р < 0.99). Это позволило объединить результаты, полученные в контрольных группах. Сравнение показателей радиоактивности во всех облученных группах дафний обнаружило значимое повышение уровня свободных радикалов (X2 (¿/) = 6.0182, р = 0.0493). Попарные сравнения дозовых групп с контролем также показали значимые отличия в группе, облученной в дозе 100 мГр (х2 (¿/) = 4.5000 (1),р = 0.0339). Для дозо-вой группы 1000 мГр показатель х2 (<!/) составил 2.0000 (1), а вероятность - 0.1573.
На рис. 1 видно, что в 1-м поколении, как и у непосредственно облученных дафний, отличие от контроля всей выборки значимо (х2 = 6.7091, р = 0.0186). Попарные сравнения с контролем обеих групп дафний, полученных от облученных в дозах 100 и 1000 мГр родителей, снова показали значимые различия (х2 = 4.5000 (1),
р = 0.0339).
ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 2 показан эффект острого воздействия у-излучения в дозах 10, 100 и 1000 мГр на выживаемость дафний, описанный нами ранее в работе [13], и его трансгенерационная передача в первое
СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ ПРИ у-ОБЛУЧЕНИИ ДАФНИЙ
307
£
о
В 90
s g
§ 80 «
ce К
g 70 S
У 60
о
IS о
50
Облученные родители
I
Необлученные потомки
Поколение F
2
Поколение F
3
0 10 100 1000 0 100 1000 Доза родительского облучения, мГр
100
В
90
80
70
60
50
40
0 100 1000 0 100 1000 Доза родительского облучения, мГр
Рис. 2. Снижение выживаемости у непосредственно облученных в малых дозах дафний-родителей и их потомства первого необлученного поколения.
Рис. 3. Эффект родительского облучения в дозах 100 и 1000 мГр на выживаемость необлученных потомков второго и третьего ^3) поколений.
*
необлученное поколение. Существуют разные объяснения механизмов, приводящих к изменению жизнеспособности облученных в малых дозах представителей биоты. Известно, что в постэмбриональный период, в который проходило облучение дафний в данном эксперименте, в сложных межмолекулярных и межклеточных взаимодействиях большую роль играют информационные сигналы из внешней среды и от соседних клеток [5, 6]. Они, по-видимому, действуют через энергетическую систему регуляции клеточных процессов, приводя к снижению выживаемости и продолжительности жизни организмов. Поскольку все регуляционные явления в клетке и в организме в целом связаны с окислительным фосфорилированием, большое значение для выживаемости облученных дафний имеет тот факт, что стрессовые реакции в клетке/организме идут с образованием активных форм кислорода (АФК), которые инициируют процессы перекис-ного окисления липидов (ПОЛ) мембран и нарушают внутримембранные потоки энергии, связанные в митохондриях с синтезом АТФ. В нашем исследовании время измерения количественнно-го уровня СР у облученных дафний приходится, видимо, на первую фазу окислительного стресса. Поэтому при облучении в дозе 100 мГр наблюдали повышение уровня СР у непосредственно облученных дафний. При дозе облучения в 1000 мГр уровень окислительного стресса возрастает и его скорость, возможно, увеличивается. Снижение уровня содержания СР может быть следствием нарушения активности ферментов, структуры митохондрий, синтеза АТФ, повреждения мембран и модификации их основных свойств, что характерно для следующего этапа окислительно-
го стрессе. Эти изменения могут привести в дальнейшем к наруше
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.