БИОХИМИЯ, 2011, том 76, вып. 2, с. 264 - 273
УДК 577.23
СВОБОДНЫЕ ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ КАК ИНДУКТОРЫ И РЕГУЛЯТОРЫ РАЗОБЩЕНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ ПРИ УЧАСТИИ ADP/ATP- И АСПАРТАТ/ГЛУТАМАТНОГО
АНТИПОРТЕРОВ
© 2011 г. В.Н. Самарцев*, Е.И. Марчик, Л.В. Шамагулова
Марийский государственный университет, 424001 Йошкар-Ола, пл. Ленина, 1; факс: (836-2)5657-81, электронная почта: samvic56@mail.ru
Поступила в редакцию 10.03.10 После доработки 21.09.10
В митохондриях печени протонофорное разобщающее действие жирных кислот осуществляется главным образом при участии белков-переносчиков анионов внутренней мембраны — АВР/АТР- и аспартат/глута-матного антипортеров. В настоящей работе для количественной оценки степени участия АВР/АТР- и ас-партат/глутаматного антипортеров в разобщающем действии жирных кислот применяли величины ресо-прягающих эффектов карбоксиатрактилата и глутамата (или аспартата) соответственно. Эти величины были определены, исходя из способности этих ресопрягающих агентов подавлять стимулированное жирной кислотой дыхание и повышать сниженный жирной кислотой мембранный потенциал. Показано, что при повышении концентрации пальмитиновой и лауриновой кислот увеличивается степень участия в разобщении АВР/АТР антипортера и в той же мере уменьшается степень участия в разобщении аспартат/глутаматного антипортера. Эти данные позволяют рассматривать жирные кислоты не только как индукторы разобщения окислительного фосфорилирования, но и как регуляторы этого процесса. Установлено, что существует линейная зависимость величины отношения ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата и глутамата от концентраций пальмитиновой и лауриновой кислот. Сравнение действия жирных кислот: пальмитиновой, миристиновой, лауриновой, каприновой и каприловой с числом атомов углерода в молекуле 16, 14, 12, 10 и 8 соответственно, показало, что по мере уменьшения гидрофобности жирных кислот коэффициент эффективности снижается в большей степени, чем величины их удельной разобщающей активности. Предполагается, что действие жирных кислот как регуляторов разобщения заключается в активации транспорта их анионов с внутреннего монослоя внутренней мембраны на наружный монослой при участии АВР/АТР антипортера и одновременно в ингибировании этого процесса при участии аспартат/глутаматного антипортера.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: митохондрии печени, жирные кислоты, разобщение, регуляция, АВР/АТР антипортер, аспартат/глутаматного антипортер.
Длинноцепочечные свободные жирные кислоты в зависимости от концентрации и экспериментальных условий оказывают различные эффекты на энергетические функции митохондрий [1—4]. В присутствии ионов кальция жирные кислоты способны индуцировать неспецифическую проницаемость внутренней мембраны митохондрий для гидрофильных соединений (открытие поры), которая подавляется хелати-рующими агентами БОТА и ЕВТА, и в некоторых случаях, но не всегда, циклоспорином А [3, 4]. При патологических состояниях, сопровождающихся накоплением жирных кислот, такое их действие на митохондрии рассматривается как одна из причин гибели клеток по типу апоп-
* Адресат для корреспонденции.
тоза и некроза [4]. В отсутствие ионов кальция (в присутствии в среде инкубации EGTA) жирные кислоты в микромолярной концентрации в митохондриях животных индуцируют разобщение окислительного фосфорилирования по про-тонофорному механизму [1—4]. Важной физиологической функцией этого так называемого «мягкого» разобщения у млекопитающих является продукция тепла для поддержания необходимой температуры тела, а также снижение в митохондриях генерации токсичных активных форм кислорода [2, 4]. В митохондриях печени в протонофорном разобщающем действии жирных кислот принимают участие белки-переносчики метаболитов внутренней мембраны митохондрий: осуществляющие обменный транспорт ADP на ATP (ADP/ATP-антипортер) и глу-
тамата на аспартат (аспартат/глутаматный антипортер) [2, 3, 5—8]. Их участием обусловлено около 70—80% разобщающей активности пальмитиновой и лауриновой кислот [2, 3, 6—8]. Другая часть разобщающей активности этих жирных кислот (20—30%), по-видимому, осуществляется по иному механизму и обусловлена участием особой системы, чувствительной к циклоспорину А, но не связанной с циклофили-ном Б [9]. Предполагается, что участие в разобщающем действии жирных кислот АОР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров заключается в переносе аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный, где эти анионы протонируются и в обратном направлении перемещаются без участия белков по механизму флип-флоп, освобождая затем протон в матрикс [2, 3].
Степень участия АОР/АТР- и аспартат/глута-матного антипортеров в разобщающем действии жирных кислот может существенно меняться. Показано, что при рН 7,0 в разобщении в большей степени участвует аспартат/глутаматный антипортер, а при рН 7,8 — АОР/АТР антипортер [7]. Добавление к митохондриям гидрофобных катионов цетилтриметиламмония приводит к таким же разнонаправленным изменениям, как и снижение рН среды инкубации с 7,8 до 7,0 [10]. В то время как добавление к митохондриям отрицательно заряженного амфифильного соединения лаурилсульфата приводит к увеличению степени участия в разобщении АОР/АТР антипортера и соответственно к уменьшению — аспартат/глутаматного антипортера [11]. Для объяснения описанных выше феноменов было предположено, что жирные кислоты в анионной форме лучше доступны для АБР/АТР антипортера, а в нейтральной форме — для аспартат/глутаматного антипортера [10]. Однако другие данные не согласуются с этой гипотезой. Так было установлено, что степень участия этих анионных переносчиков в разобщении зависит также от длины цепи жирных кислот: при применении относительно короткоцепочечных каприновой или лауриновой кислот, в разобщении в большей степени участвует аспартат/глутаматный антипортер, чем АБР/АТР антипортер, а при применении длинноцепочечной пальмитиновой кислоты — АОР/АТР антипортер, чем аспартат/глутаматный антипортер [8].
Предельные жирные кислоты, имеющие различное количество атомов углерода в молекуле, сильно отличаются друг от друга по растворимости в липидах [12, 13]. Так, с увеличением длины ацильной цепи всего на два атома углерода коэффициент распределения липид/во-да для жирных кислот возрастает в 14 раз [12,
13]. Можно ожидать, что при одной и той же применяемой концентрации количество длин-ноцепочечных жирных кислот в гидрофобной области внутренней мембраны митохондрий будет больше, чем короткоцепочечных. Интересно предположить, что степень участия ADP/ ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров в разобщении будет зависеть от количества анионов жирных кислот в гидрофобной области внутренней мембраны, а не от соотношения их анионных и нейтральных форм, как предполагалось ранее [10]. Это позволяет рассматривать жирные кислоты не только как разобщители окислительного фосфорилирования, но и как регуляторы этого процесса.
Целью настоящего исследования было выяснение роли жирных кислот в митохондриях печени как регуляторов индуцированного ими разобщения при участии ADP/ATP- и аспартат/ глутаматного антипортеров. Для достижения этой цели необходимо было выяснить, каким образом способность карбоксиатрактилата и глутамата подавлять разобщающее действие пальмитиновой или лауриновой кислот зависит от концентрации этих разобщителей. Полученные данные рассматриваются как свидетельство того, что при увеличении концентрации пальмитиновой или лауриновой кислот повышается степень участия в разобщении ADP/ATP антипортера и на ту же величину снижается степень участия в разобщении аспартат/глутаматного антипортера. Это позволяет говорить о жирных кислотах не только как об индукторах разобщения при участии вышеназванных переносчиков, но и как о регуляторах этого процесса.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Митохондрии из печени белых половозрелых крыс-самцов массой 220—250 г выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования с последующим освобождением от эндогенных жирных кислот с помощью свободного от жирных кислот БСА как подробно описано ранее [6]. Среда выделения содержала 250 мМ сахарозу, 1 мМ ЭГТА, 5 мМ Mops-КОН, рН 7,4. Концентрацию белка митохондрий определяли биуретовым методом, в качестве стандарта использовали БСА. Во время проведения эксперимента суспензию митохондрий (60—70 мг митохондриального белка в 1 мл) хранили на льду в узкой пробирке («Eppendorf», Германия). Дыхание митохондрий регистрировали с помощью кислородного электрода типа Кларка и полярографа LP-9 в термостатируемой ячейке при температуре 25°. Среда инкубации
содержала 250 мМ сахарозу, 5 мМ янтарную кислоту, 3 мМ МяС12, 0,5 мМ ЭГТА, 10 мМ Мор8-КОН, рН 7,4. При исследовании разобщающего действия жирных кислот в полярографическую ячейку сразу после митохондрий (~1,0 мг/мл) добавляли ротенон (2 мкМ) и олигомицин (2 мкг/мл), далее через 2 мин после этого исследуемую жирную кислоту в указанной на рисунках концентрации, далее через 1,5 мин — 1 мкМ карбоксиат-рактилат, через 1,5 мин — 2 мМ глутамат и еще через 1,5 мин — 50 мкМ 2,4-динитрофенол. В специальных опытах было установлено, что в этих концентрациях карбоксиатрактилат и глу-тамат в максимальной степени подавляли разобщающее действие жирных кислот, а 2,4-ди-нитрофенол вызывал максимальную стимуляцию дыхания митохондрий.
Мембранный потенциал (Л у) оценивали по распределению ТФФ+, концентрацию которого регистрировали ТФФ+-чувствительным электродом [14] при 25°. В этих экспериментах в среду инкубации дополнительно добавляли 1,6 мкМ ТФФ+ и после внесения митохондрий — 20 нМ нигерицин. Нигерицин был необходим для того, чтобы перевести ЛрН в Лу. В специальных опытах было установлено, что концентрация нигерицина 20 нМ была оптимальной, так как последующее ее увеличение не приводило к повышению Лу как в отсутствие, так и в присутствии пальмитиновой кислоты. Величину Лу рассчитывали с учетом неэнергозависимого связывания ТФФ+ с митохондриями по уравнению Нернста [14]. Объем матрикса был взят как 1 мкл/мг белка — среднее значение недоступного для сахарозы объема митохон
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.