МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 6, с. 1050-1058
_ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ _
БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ
УДК 577.217
СВОЙСТВА АНТИГЕНОМНОГО HDV-РИБОЗИМА, СОСТОЯЩЕГО
ИЗ ДВУХ МОЛЕКУЛ РНК
© 2004 г. В. А. Алексеенкова, Т. И. Белянко, М. А. Лукин, Л. П. Савочкина*, Р. Ш. Бибилашвили
Российский кардиологический научно-производственный комплекс Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, 121552 Поступила в редакцию 05.04.2004 г.
Сконструирован транс-вариант B : LS природного HDV-рибозима, состоящий из двух молекул РНК: субстрат-содержащей (LS) и ферментной (B). Рибозим B : LS отличается от синтезированных ранее транс-рибозимов длиной и нуклеотидной последовательностью составляющих его молекул РНК (33 и 34 нт соответственно). Кроме того, РНК синтезированного рибозима способны ассоциировать друг с другом при комнатной температуре без расщепления LS, так как скорость расщепления LS в этих условиях очень мала, что позволяет исследовать процесс ассоциации целых РНК, составляющих рибозим. Мы показали, что при повышении температуры происходит расщепление LS и константа скорости расщепления транс-варианта B : LS при 50°С близка к константам пермута-ционных вариантов цис-рибозимов, исследованных нами ранее. Также транс-рибозим демонстрирует схожий с цис-рибозимом характер зависимости от параметров реакции (концентрации ионов Mg2+, рН среды, температуры). Некоторые наблюдаемые отличия обусловлены, по-видимому, условиями ассоциации взаимодействующих РНК при образовании каталитически активной структуры. B : LS рибозим, как и другие транс-рибозимы, демонстрирует способность к многократному использованию ферментной цепи В при избытке субстратной LS. Кинетическая схема реакции расщепления транс-рибозима B : LS приведена на сайте www.cardio.ru/labgen/RZ_r.html. Вся совокупность полученных данных показывает, что сконструированный нами транс-вариант может быть использован в качестве модели для исследования процесса саморасщепления HDV-рибозима.
Ключевые слова: HDV-рибозим, транс-активная форма, ферментативная активность.
PROPERTIES OF ANTIGENOMIC HDV RIBOZYME CONSISTING OF TWO RNA CHAINS, by V. A. Alek-seenkova, T. I. Belyanko, M. A. Lukin, L. P. Savochkina*, R. Sh. Beabealashvilli (Russian Cardiology Research-and-Production Center, Ministry of Health, Moscow, 121552 Russia; E-mail: lasav@cardio.ru). B : LS ri-bozyme, a trans-variant of naturally occurring HDV ribozyme, has been constructed. The ribozyme consists of a substrate-containing LS chain and an enzyme B chain and differs from previously constructed trans-ri-bozymes in the length and nucleotide sequence of its oligonucleotide chains (34 and 33 bp, respectively). The chains readily associate with each other at a room temperature while the LS cleavage reaction at this temperature is negligible slow, which allowed us to investigate the association of the intact chains. At the same time the self-cleavage rate constant for the trans-ribozyme B : LS at 50°C is close to those for the previously studied permuted cis-ribozymes, especially LSB variant. In addition, the dependence on the reaction conditions (Mg2+ concentration, pH, temperature) of the trans-ribozyme was similar to that of cis-ribozyme. Similar to other trans-ribozymes, B : LS ribozyme demonstrates the ability for multiple use of the enzyme B-chain with an excess of the substrate LS chain. The kinetics model of self-cleavage reaction for B : LS is presented in http://www.cardio.ru/labgen/RZ_r.html. Taken together, our results show that the original trans-variant of HDV ribozyme can be used as a model for the investigation of self-cleavage process of HDV ribozymes.
Вирус гепатита дельта (ИБУ) - сателлитный вирус, инфицирующий клетки человека, уже инфицированные вирусом гепатита В. ИБУ-геном представляет собою кольцевую однонитевую РНК длиной около 1700 нуклеотидов (н.). РНК реплицируется по механизму катящегося кольца, что приводит к образованию геномной и антигеномной РНК. Обе РНК обладают саморасщепляющей активностью (рибозимной активностью), которая
* Эл. почта: lasav@cardio.ru
проявляется и in vitro [1, 2]. Определены границы каталитических доменов для обеих HDV-РНК [3, 4], подробно исследованы зависимость каталитической активности от последовательности нуклеотидов и вторичной структуры каждого домена. Эти домены двух РНК, имеющие много общих особенностей, в том числе минимальную длину, необходимую для протекания реакции саморасщепления, равную 85 н., названы геномным и антигеномным HDV-рибозимами.
Согласно современным представлениям о пространственной организации ИБУ-рибозима [5-7], геномный и антигеномный рибозимы укладываются в одинаковые структуры, содержащие пять двуспиральных участков ^1.1, s1, s2, s3, s4), три однонитевых последовательности, соединяющие их (/1/2, /1/4 и /4/2) и две петли (13 и 14). Молекула природного ИБУ-рибозима может быть представлена в виде трех функциональных субфрагментов: субстратного (8), содержащего расщепляемый участок (субстрат), субстрат-связывающего (В), содержащего участок, комплементарный субстрату, и фрагмента Ь, образующего вместе с фрагментом В активный центр рибозима. В природном рибозиме эти субфрагменты расположены в 5'—3'-направлении в последовательности 8 ^ В ^ Ь (8ВЬ). Реакция саморасщепления природного ИБУ-рибозима осуществляется внутри одной молекулы РНК (цмс-активность). Однако показано, что фосфодиэфирная связь между любыми субфрагментами ИБУ-рибозима может быть разорвана, и при ассоциации субфрагментов друг с другом образуются транс-активные формы, также способные к расщеплению субстрата, как и природный цмс-рибозим [8—12]. Транс-активная форма ИБУ-рибозима является удобной моделью для исследования многих параметров процесса расщепления рибозима (субстратной специфичности, кинетики образования субстрат-ферментных комплексов, их пространственной организации).
Мы сконструировали транс-активную форму ИБУ-рибозима, образующуюся в результате ассоциации двух молекул РНК, содержащих субфрагменты ЬБ и В, длиной 34 и 33 н. и показали способность полученного транс-варианта к осуществлению реакции расщепления. Кроме того, мы исследовали влияние различных параметров реакции на кинетику расщепления исследуемого транс-рибозима и показали его подобие цмс-аналогу.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Синтез и очистка рибоолигонуклеотидов транс-рибозима выполнены твердофазным фосфотри-эфирным методом, описанным в [13]. Синтезированы следующие рибоолигонуклеотиды:
Ь8: 5'^а觧сиа১§а§иа§аисиис§§§ис§§саТ-3'
В: 5'-§сиссассиссис§с§§исс§асс觧§саисС-3'
Заглавные буквы — дезоксизамены на 3'-конце рибоолигонуклеотида.
Синтез ДНК-матрицы и РНК цмс-рибозимов проводили как описано в предыдущей статье. Ме-чение олигонуклеотидов введением 32Р в 5'- и 3'-концевое положение также описано в предыдущей статье [14].
Анализ саморасщепляющей активности проводили следующим образом: смесь 5'-32Р-мечено-
го олигонуклеотида LS и олигонуклеотида B инкубировали в течение 5 мин при указанной температуре в буфере для расщепления (50 мМ HEPES-NaOH, pH 7.5), реакцию расщепления инициировали добавлением предварительно прогретого при температуре реакции MgCl2 до 10 мМ и продолжали инкубацию в течение выбранного отрезка времени при той же температуре. Реакцию останавливали добавлением равного объема "стоп"-раствора, содержащего 85% формамида, 25 мМ EDTA и по 0.01% бромфенола и ксиленцианола. Продукты реакции анализировали электрофорезом в 15%-ном ПААГ, содержащем 7 М мочевину, 90 мМ Трис-бо-ратного буфера, рН 8.5, 25 мМ EDTA при 50°С с последующим сканированием радиоавтографов на приборе "PhosphorImager SI" фирмы 'Molecular Dynamics" (США) с использованием программы ImageQuant 5.1. Все эксперименты выполняли не менее трех раз и ошибка измерений составляла не более 20%.
Влияние рН на реакцию саморасщепления изучали с использовнием 50 мМ муравьиной кислоты, 50 мМ №Ас-буфера, 50 мМ Hepes-NaOH, 50 мМ глицин-NaOH, проверяя pH буферов при температуре инкубации. При исследовании влияния денатурирующих веществ на реакцию саморасщепления предварительный прогрев рибозима проводили в буфере для расщепления при температуре инкубации в присутствии денатурантов.
Анализ кинетических кривых выполняли с использованием системы электронных таблиц Microsoft Excel. Константу скорости реакции k1 определяли, приняв реакцию за псевдомономолеку-лярную, как описано в работе [14], согласно уравнению A/A0 = ЕР + (1 - EP) х exp(-&i х t), где A/A0 - доля молекул РНК LS, не расщепившихся за время t; k1 - кажущаяся константа скорости начальной фазы реакции и EP - доля молекул рибозима, скорость расщепления которых не подчиняется кинетике первого порядка начальной фазы реакции. Значение k1 определяли при различных концентрациях РНК В и постоянной концентрации 32Р-меченного по 5'-концу LS. Реакцию проводили при 50°С в буфере для расщепления в присутствии 10 мМ MgCl2. Каждую константу скорости вычисляли, по крайней мере, из трех измерений. Величины, полученные из независимых экспериментов, отличались не более чем на 15%. Полученные значения k1 затем откладывали как функцию концентрации РНК В для определения кинетических параметров kKam, Км' и ^ат/Км'. Начальную скорость реакции V0 определяли, измеряя степень расщепления LS в мин на начальном участке кривой расщепления.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Транс-аналоги HDV РНК обычно получают разрывом фосфодиэфирной связи в однонитевых
участках 14 и J1/2, соединяющих между собой субфрагменты HDV-цмс-рибозима [15]. Разрыв фос-фодиэфирной связи в последовательности 14 молекулы HDV-рибозима приводит к образованию олигонуклетидов, содержащих SB и L, которые ассоциируют друг с другом с восстановлением двунитевых участков s2 и s4 и образованием ри-бозима SB : L [8, 9]. При разрыве связи в последовательности j1/2 образуются олигонуклеотиды S и BL, при ассоциации которых восстанавливается двунитевой участок si и образуется транс-вариант S : BL, также способный к саморасщеплению [4, 10]. Гранс-варианты обычно состоят из короткого олигонуклеотида длиной около 10 н. и длинного
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.