БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 6, с. 490-505
УДК 577.333:541.64
СВОЙСТВА БИСЛОЕВ НЕНАСЫЩЕННЫХ ФОСФОЛИПИДОВ:
ВЛИЯНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА
© 2007 г. А. Л. Рабинович1, В. В. Корнилов2, Н. К. Балабаев2, Ф. А. М. Леермакерс3, А. В. Филиппов4
1Институт биологии Карельского научного центра РАН, 185910, Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11; факс (8142)769810; электронная почта: rabinov@krc.karelia.ru 2Институт математических проблем биологии РАН, 142290, Пущино Моск. обл. 3Университет Вагенингена, 6703 НВ, Вагенинген, Нидерланды 4Казанский государственный университет, 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18
Поступила в редакцию 14.03.2007 г.
Исследованы свойства гидратированных бислоев ненасыщенных фосфатидилхолинов (ФХ) - чистых и содержащих 40 мол. % холестерина. Использованы комбинации различных методов: молекулярной динамики, самосогласованного поля и ядерного магнитного резонанса с импульсным градиентом магнитного поля. Бислои были образованы из молекул 18:0/18:1(п-9)см' ФХ, 18:0/18:2(п-6)си- ФХ, 18:0/18:3(п-3)а'5 ФХ, 18:0/20:4(п-6)см ФХ и 18:0/22:6(п-3)см ФХ. Рассчитаны коэффициенты латеральной самодиффузии молекул ФХ во всех бислоях, распределения плотности атомов и групп атомов относительно нормали к поверхности бислоев, профили параметров порядка связей С-Н и С-С каждой углеводородной цепи фосфолипидов относительно нормали к поверхности каждого бислоя. Показано, что при переходе от чистого бислоя к соответствующему бислою с высоким содержанием холестерина коэффициент латеральной самодиффузии молекул ФХ уменьшается, а с ростом степени ненасыщенности одной из цепей молекул ФХ в ряду однотипных бислоев - увеличивается. Наличие холестерина в бислое способствует вытягиванию насыщенных и полиненасыщенных цепей молекул ФХ. Конденсирующий эффект холестерина для двойных связей С=С полиненасыщенных цепей оказывается более заметным, чем для связей С-С насыщенных цепей.
Природные мембраны участвуют в регуляции многих процессов, поэтому состав и соотношение их молекулярных компонентов многообразны. Основу мембран составляют молекулы фосфолипидов, и одним из весьма распространенных компонентов является холестерин, который оказывает существенное влияние на физико-химические свойства липидной матрицы [1, 2]. В частности, исследования, проведенные экспериментальными [3-14] и теоретическими [15-29] методами, показали, что в присутствии холестерина в мембране изменяется подвижность молекул фосфолипидов. Другая важная физическая характеристика любой мембранной системы - характер упорядоченности связей в углеводородных цепях фосфолипидов. Влияние холестерина на степень этой упорядоченности также активно изучается как экспериментально [30-33], так и теоретически [16, 19, 22, 24, 29, 34-40]. Существенная доля липидных молекул, из которых состоят природные мембраны, - это ненасыщенные фосфолипиды. В мембранных системах они играют важнейшую функциональную роль [41], ряд свойств ненасыщенных липидов в чистых монослоях и бислоях уже исследован в работах авторов этой статьи [42-49]. Вместе с тем данных об их свойствах меньше, чем о свойствах липидов насыщенных. Понимание механизмов
влияния холестерина на свойства мембраны на молекулярном уровне также не достигнуто.
В настоящей работе методами молекулярной динамики (МД), самосогласованного поля (ССП) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР) с импульсным градиентом магнитного поля исследована совокупность гидратированных бислоев, образованных молекулами фосфатидилхолинов (ФХ) разной степени ненасыщенности, - чистых, а также содержащих 40 мол. % холестерина. В молекулах ФХ в положении sn-1 располагалась насыщенная углеводородная цепь, содержащая 18 атомов углерода, 18:0, а в положении sn-2 - одна из пяти ненасыщенных неразветвленных цепей, содержащих 18, 20 или 22 атома углерода и 1, 2, 3, 4 или 6 метиленпрерыва-ющихся двойных связей cis. Рассмотрены бислои из молекул 18:0/18:1(п-9)с« ФХ, 18:0/18:2(п-6)с« ФХ, 18:0/18:3(п-3)с« ФХ, 18:0/20:4(п-6)с« ФХ и 18:0/22:6(п-3)с« ФХ. Исследовано влияние холестерина на величину коэффициентов латеральной самодиффузии молекул ФХ, а также зависимость этих коэффициентов от степени ненасыщенности одной из углеводородных цепей. Рассчитаны профили плотности масс атомов, профили параметров порядка связей С-Н и С-С каждой углеводородной цепи молекул липидов относительно нор-
а б
Рис. 1. Исходная (а) конфигурация расчетной ячейки одного из пяти чистых гидратированных бислоев 18:0/20:4(п-6)см' ФХ и типичная конфигурация системы в процессе построения траектории методом молекулярной динамики (•). Ось 2 отвечает нормали к поверхости бислоя, использовано объемное представление атомов всех молекул.
мали к поверхности бислоя и изучено влияние холестерина на эти характеристики.
МОДЕЛИ И МЕТОДЫ РАСЧЕТА, МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛЫ
Метод МД. Моделирование чистых гидратированных бислоев на основе перечисленных выше молекул ФХ подробно описано в работах [44, 45, 47]. Данная методика с минимальными изменениями была перенесена на бислои с холестерином. Моделируемые системы, как чистые, так и с содержанием 40 мол. % холестерина, размещались в расчетных ячейках, имеющих форму прямоугольного параллелепипеда (рис. 1, 2), с периодическими по осям X, У и 2 граничными условиями (ось 2 - это нормаль к поверхности бислоя). Каждая из пяти бислойных систем с холестерином содержала 96 одинаковых молекул ФХ определенного типа, 64 молекулы холестерина (это 40 мол. % всех липи-дов бислоя) и 3840 молекул воды (по 24 молекулы Н20 на любую липидную молекулу) (рис. 2). В пяти чистых бислоях, соответственно, содержалось 96 молекул ФХ и 2304 молекулы воды (рис. 1). Исходная упаковка молекул липидов в бислоях была гексагональной, конфигурации молекул липидов -кристаллоподобными, с вытянутыми вдоль оси 2
углеводородными цепями в транс-конформациях. Среди молекул ФХ в пяти гетерогенных бислоях равномерно располагались молекулы холестерина (рис. 2а). Химическое строение молекул ФХ и холестерина во всех системах воспроизведено строго, все атомы водорода учтены явно.
Потенциальная энергия и каждого бислоя была задана в виде суммы энергий атом-атомных взаимодействий:
N
и
вал.связей
х I и + X и + X и
+
+
I иооР + I I + I I ие Ц( и ^ ^ + ие).
+
+
Суммирование здесь проведено как внутри отдельных молекул (первая скобка), так и между атомами разных молекул: ФХ и воды, ФХ и холестерина, холестерина и воды (вторая скобка). Были учтены следующие компоненты энергии: энергия валентных связей (иъ), валентных углов (иа), торсионных углов (и), неплоских отклонений атомов, примыкающих к двойным связям С=С и С=О
N
N
вал.углов
торс. углов
N
Рис. 2. Исходная (а) конфигурация расчетной ячейки системы гидратированный липидный бислой 18:0/22:6(п-3)сг^ ФХ -40 мол. % холестерина (расположение молекул холестерина - регулярное) и типичная конфигурация системы в процессе построения траектории методом молекулярной динамики (•). Ось 2 отвечает нормали к поверхности бислоя, использовано объемное представление атомов всех молекул.
(Uoop), невалентных взаимодействий атомов (UvdW) и электростатическая энергия (Ue). В уравнениях движения атомов каждой из моделируемых систем были фиксированы число атомов, давление и температура (303 К), отвечающая жидкокристаллическому состоянию чистых ФХ в эксперименте [50]. Численное интегрирование уравнений движения проведено с использованием алгоритма Верле [51], шаг интегрирования при релаксации систем и построении для них расчетных траекторий составлял 10-15 с. Запись траекторий для каждого бислоя ФХ с холестерином производилась с интервалом 10-13 с, для чистых бислоев ФХ - с интервалом 5 х х 10-14 с. На рис. 16, 26 представлены конфигурации липидных бислоев в расчетных ячейках в процессе построения МД-траекторий. Средние характеристики каждого бислоя с холестерином вычисляли по траекториям длиной 2 х 10-9 с (20000 конфигураций), чистого бислоя - по траекториям длиной ~10-9 с (~20000 конфигураций). Оценены коэффициенты латеральной самодиффузии молекул ФХ, рассчитаны профили плотности масс атомов и групп атомов, профили параметров порядка связей C-H и C-C каждой углеводородной цепи молекул фосфолипидов относительно нормали к поверхности бислоя.
Метод ЯМР. Методом 1Н-ЯМР изучена латеральная самодиффузия в чистых бислоях 18:0/18:1(n-9)cis ФХ, 18:0/18:2(n-6)cw ФХ, 18:0/20:4(n-6)cis ФХ и 18:0/22:6(n-3)cis ФХ и в таких же бислоях ФХ с 40 мол. % холестерина. Липиды приобретены в фирме "Avanti Polar Lipids" (Alabaster, AL, США). Все манипуляции с полиненасыщенными липидами производили в герметичной
камере, содержащей высушенный азот. Для получения макроскопически ориентированных бислоев фосфолипид или его смесь с холестерином растворяли в смеси из 20% метанола и 80% пропанола при концентрации 15 мг/мл. Затем по 25 мкл раствора наносили на каждую из примерно 30 стеклянных пластинок (5 х 14 мм2). Растворитель испаряли в потоке сухого газа азота при атмосферном давлении, а затем вакуумировали. Стеклянные пластинки складывали стопкой в ампулу с квадратным сечением и помещали во влажную атмосферу азота для гидратации. Из воды, используемой для гидратации, предварительно был удален растворенный кислород. Перед измерениями образцы герметизировали. Для проверки качества ориентации образцов использовали скрещенные поляроиды. Более детально технология приготовления макроскопически ориентированных бислоев описана в [6]. Измерения самодиффузии производили на ЯМР-спектрометре Chemagnetics Infinity (Varian, Fort Collins, CO) на частоте протонов 100 МГц, оборудованном датчиком ЯМР с гониометром, который обеспечивал ориентацию нормали бислоев под "магическим углом" к направлению постоянного магнитного поля. При ориентации под "магическим углом" (54.7°) вращение молекулы липида вокруг своей оси приводит к частичному усреднению диполь-дипольных взаимодействий протонов [6], сигнал эхо возрастает в сотни раз, и удается получить уширенный спектр 1Н-ЯМР от липидов. Использовали последовательность "стимулированного эхо" с Фурье-преобразованием. Регистрировали диффузионные затухания A(k), где A(k
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.