БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 10, с. 1430 - 1440
УДК 577.152.1
СВОЙСТВА ДИКАРБОКСИЛАТНОГО ТРАНСПОРТЕРА ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae*
© 2006 г. Д.А. Аливердиева1**, Д.В. Мамаев2,
Д.И. Бондаренко2, |К.Ф. Шольц
1 Прикаспийский институт биологических ресурсов ДНЦ РАН, 367025 Махачкала, ул. М. Гаджиева, 45, Россия, электронная почта: dinara0195@mail.ru
2 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский проспект, 33
Поступила в редакцию 11.05.06 После доработки 23.06.06
2
Транспорт сукцината в клетки Saccharomyces cerevisiae измеряли с помощью эндогенной сопряженной сук-цинатоксидазной системы митохондрий клеток. Зависимость скорости окисления сукцината от концентрации субстрата имела вид кривой с насыщением. При нейтральных значениях рН величина Км митохондри-альной «сукцинатоксидазы» в пять раз меньше величины Км «сукцинатоксидазы» клеток. Не проникающий через плазматическую мембрану О-пальмитоил-Ь-малат полностью подавлял дыхание клеток на сукцина-те, но не на глюкозе или пирувате. Линейный характер ингибирования в координатах Диксона свидетельствует о том, что транспорт сукцината через плазмалемму лимитирует скорость его окисления. О-Пальми-тоил-Ь-малат, как и Ь-малат, были конкурентными ингибиторами (соответственно К = 6,6 ± 1,3 мкМ и 17,5 ± 1,1 мМ). Скорость транспорта сукцината конкурентно ингибировало и производное малоната — 2-ундецилмалонат (К = 35,6 ± 4,4 мкМ), но не фосфат. Транспорт сукцината через плазматическую мембрану ^ cerevisiae не сопряжен с транспортом протонов, но требует присутствия ионов натрия в среде. Установлено, что в плазматической мембране ^ cerevisiae присутствует переносчик, катализирующий транспорт дикарбоксилатов (сукцината и, скорее всего, Ь-малата и малоната).
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: сукцинат, Ь-малат, малонат, О-пальмитоил-Ь-малат, конкурентное ингибирование, дикарбоксилатный транспортер плазматической мембраны Saccharomyces cerevisiae, протонофоры БССР и 8Ь, симпорт с натрием.
До настоящей работы было принято считать, что в плазматической мембране & cerevisiae отсутствует опосредованная белком система транспорта С4-дикарбоксилатов [1—4]. При рН 3,0 был продемонстрирован только транспорт Ь-малата, опосредованный диффузией его протонирован-ной (незаряженной) формы [3]. Опираясь на это представление, французские исследователи [4] экспрессировали в клетках дрожжей £ cerevisiae ген МАЕ1, кодирующий дикарбоксилатный переносчик Schizosaccharomyces pombe [5], и показали увеличение скорости транспорта экзогенного ма-лата, чувствительное к действию протонофора [4]. Ранее нами было показано, что после продолжительной преинкубации клеток штамма & cere-\isiae У-503 при 0° при рН 5,5 (в этих условиях ма-
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 06-133, 10.09.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
ловероятна или даже исключена диффузия ди-карбоксилата в недиссоциированной форме), сукцинат вызывал значительную стимуляцию дыхания, чувствительную к действию малоната, ингибитора сукцинатдегидрогеназы митохондрий [6]. Было высказано предположение о том, в плазмалемме & cerevisiae может присутствовать дикарбоксилатный переносчик.
Ранее нами было установлено, что высшие алифатические производные С4-дикарбоксила-тов являются эффективными ингибиторами ди-карбоксилатного транспортера митохондрий печени [7], а О-пальмитоил-Ь-малат не проникает через плазматическую мембрану £ cerevisiae при рН 5,5 [8]. В этих условиях можно ожидать его воздействия на белки только этой мембраны. Исследования на интактных клетках имеют определенные преимущества, поскольку позволяют избежать возможных изменений свойств дикарбоксилатного транспортера, связанных с его реконструкцией в липосомы, как это было
показано для трикарбоксилатного [9] и адени-латного [10] переносчиков митохондрий. Использование эндогенной системы окисления сукцината митохондриями в качестве сопряженной системы для измерения скорости входа субстрата в клетку позволяет избежать применения радиоактивно меченных субстратов. Отмечалось, что их использование в интактных клетках может приводить к артефактам, связанным с адсорбцией субстрата на поверхности клетки и с его удерживанием в периплазме [11], а также с метаболическими превращениями меченого субстрата, что значительно затрудняет анализ [12].
Изученные к настоящему времени дикарбок-силатные переносчики плазматической мембраны дрожжей, в частности, Sohizosaccharomyces pombe [13], Candida utilis [14], Kluyveromyces marxianus [15], Pachysolen tannophilus [16] осуществляют транспорт субстрата в симпорте с протоном. Как правило, транспортеры способны переносить кроме L-малата и сукцината другие дикарбокси-латы, например, переносчик Sch. pombe [5] — окса-лоацетат, малонат и малеат, K. marxianus [15] — D-малат, фумарат и оксалоацетат. Натрийзависи-мые симпортеры дикарбоксилатов в плазмалем-ме высших эукариот описаны [17, 18, 19], а в дрожжах неизвестны. В плазматической мембране S. cerevisiae существует Na+/H+ антипортер и №+-зависимый симпортер ионов фосфата [20, 21], что предполагает возможность создания при определенных условиях (щелочные значения рН, присутствие NaCl в среде) градиента Na+ на этой мембране. Для гипотетического дикарбоксилат-ного переносчика S. cerevisiae субстратная специфичность и механизм транспорта не изучены.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали штамм S. cerevisiae Y-503 (коллекция Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИГенетика, Россия), полученный в Прикаспийском институте биологических ресурсов ДНЦ РАН [22]. Принадлежность штамма к таксону S. cerevisiae была показана с помощью метода с использованием UP-PCR (universal primer-polimerase chain reaction) в группе С. Булата (Лаборатория генетики эукариот, Отделение молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики РАН). В ряде специально оговоренных случаев использовали штамм S. cerevisiae S288c, полученный от др. Малле (L. Mallet) (Институт генетики и микробиологии Парижского университета). Выращивание дрожжей, (в течение 10 ч) в условиях, способствующих проли-
ферации митохондрий, предварительную обработку клеток и измерение дыхания проводили как описано нами ранее [6]. Надо отметить подготовку суспензии отмытых дрожжей к опытам по измерению дыхания. Проводили аэробную преинкубацию при 0° (магнитик, полупогруженный в суспензию, при перемешивании активно аэрировал ее). Часть опытов проведена на клетках, выращенных в синтетической среде на основе YNB (yeast nitrogen base), это особо оговорено в подписи к рисункам. Митохондрии выделяли по модифицированной методике [23], так для получения сферопластов использовали ли-тиказу («Sigma», США), осаждение митохондрий проводили при 5000 g в течение 20 мин. Белок митохондрий определяли по модифицированной методике Брэдфорд [24]. Дыхание клеток измеряли при 30° в 50 мМ калий-фосфатном буфере (pH 5,5 или 6,5) и, в определенных случаях, в натрий-фосфатном буфере (pH 5,5). Дыхание митохондрий измеряли в среде, содержащей 0,6 М маннит, 1 мМ ЭДТА-Na, 10 мМ KH2PO4, 10 мМ MES, pH 6,5. Уровень кислорода определяли амперометрически [6, 25] в стационарных условиях. Все активности (в том числе транспортеров разных субстратов), измеренные с помощью «оксидазных» сопряженных систем, приведены в нмоль 02/мин.
Влияние эффекторов на окисление пирувата исследовали в условиях, когда скорость лимитировал переносчик плазматической мембраны (после 2—6 ч аэробной преинкубации клеток при 0°, при концентрации субстрата: 5—24 мМ). Активность «пируватоксидазы» составляла 162,2 ± 8,1 нмоль/мин/мг сухого веса, а величина KM — 7,62 ± 2,5 мМ (среднее значение из пяти независимых измерений). Это значение сходно с величиной KM по пирувату монокарбоксилат-ного Н+-симпортера плазматической мембраны S. cerevisiae (5,8—4,1 мМ) [26], но существенно отличается от KM монокарбоксилатного переносчика в митохондриях S. cerevisiae (0,8 мМ) [27].
Эксперименты потребовали от нас использования реактивов, свободных даже от небольших примесей ацетата, поскольку, как мы показали, его сродство к «ацетатоксидазе» клеток было высоким (KM = 35 ± 15 мкМ).
Поскольку наблюдаемые параметры инги-бирования (I50) O-пальмитоил-Ь-малата зависели от концентрации митохондрий или клеток (B), истинную величину I50 определяли путем экстраполяции к нулевой концентрации орга-нелл в координатах I50 (B), как было предложено Гарвеем [28]. Линейный характер зависимости служил основанием для применимости метода [7].
В работе использовали L-яблочную кислоту («Sigma»), D(+)-глюкозу моногидрат («Merk»,
Германия), маннит («Merk»), БСА («Calbiochem», США), Tris («Serva», Германия), MES («Serva»), дрожжевой экстракт и среду YNB («Difco Laboratories», США), протонофоры SF-4867 (3,5-ди-трет-бутил-4-оксибензилиденмалоно-нитрил («Sumitomo Chem. Co.», Япония)) и FCCP (carbonyl cyanide 4-trifluoromethoxy)phe-nylhydrasone («Aldrich», США)), 2-теноилтри-фторацетон и NaOH («Fluka», Швейцария), ли-тиказу («Sigma») и отечественные препараты: KH2PO4 и KOH квалификации о.с.ч. Янтарную и малеиновую кислоты, ЭДТА, пируват и сукци-нат натрия перекристаллизовывали. Препараты O-пальмитоил-L-малата и 2-ундецилмалоната синтезировали в нашей лаборатории [7]. Нерастворимые в воде реактивы растворяли в диме-тилсульфоксиде.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Первым этапом наших исследований был подбор условий для измерения транспорта дикарбо-новых кислот (сукцината и малата) через плаз-
мал емму дрожжевой клетки, когда диффузия протонированной, т.е. незаряженной формы ди-карбоксилатов практически отсутствует (значения pH 5,5 и выше). Ранее нами было показано, что клетки S. cerevisiae, выращенные при низкой концентрации глюкозы, т.е. в отсутствии глю-козной репрессии [29], обладали существенным «эндогенным дыханием». Оно стабилизировалось примерно через 15 мин инкубации при 30° [6]. Это дыхание не было чувствительно к мало-нату и теноилтрифторацетону — специф
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.