БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 3, с. 379 — 385
УДК 577.152.3
СВОЙСТВА ЭНДОЛИТИЧЕСКОЙ ТРАНСГЛИКОЗИЛАЗЫ БАКТЕРИОФАГА phiKZ Pseudomonas aeruginosa, КОДИРУЕМОЙ ГЕНОМ 144
© 2006 г. К.А. Мирошников*, Н.М. Файзуллина, Н.Н. Сыкилинда, В.В. Месянжинов
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; факс: (495)335-0812, электронная почта: root@mail.ibch.ru, www.ibch.ru,kmi@ibch.ru
Поступила в редакцию 16.12.04 После доработки 13.04.05
Установлено, что эндолизины бактериофагов, разрушающие клеточную стенку бактерий, являются перспективными ферментами для терапии бактериальных инфекций. Отмечено, что геном гигантского фага phiKZ Pseudomonas aeruginosa кодирует два эндолизина (продукты генов (п.г.) 144 и 181), гомологичных ли-тическим трансгликозилазам. Ген 144, кодирующий белок, содержащий 260 аминокислотных остатков, был клонирован в плазмидный вектор экспрессии. Показано, что полученный в Escherichia coliрекомбинантный п.г. 144 разрушает клеточные стенки P. aeruginosa, обработанные хлороформом. Обнаружено, что белок имеет преимущественно а-спиральную конформацию и в растворе находится в стехиометрическом равновесии мономер : димер : тример. П.г. 144 является структурным компонентом хвоста бактериофага phiKZ, предположительно его базальной пластинки.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Pseudomonas aeruginosa, бактериофаг phiKZ, эндолизин, энзибиотик.
Появление патогенных бактерий, устойчивых к антибиотикам, потребовало разработки новых эффективных методов терапии. В последнее время обсуждается возможность использования вирусов бактерий (бактериофагов) в качестве альтернативных противобактериальных средств [1, 2]. Недавно для терапии бактериальных инфекций было предложено использовать литические ферменты бактериофагов — эндолизины, которые были названы энзибиотиками [3].
Эндолизины — это литические ферменты, которые специфично распознают и расщепляют пептидогликаны клеточной стенки бактерий. Как правило, все ферменты данной направленности по механизму расщепления субстрата относятся к одной из трех групп: лизоцимоподоб-ным мурамидазам (ЕС 3.2.1.17), М-ацетилмура-моил-Ь-аланинамидазам (ЕС 3.5.1.28) и пепти-дазам (ЕС 3.4.17).
Бактериофаги используют эндолизины на двух этапах своего развития. При инъекции нуклеиновой кислоты вируса внутрь хозяйской бак-
Принятые сокращения: РМОТ — о-фенилметил-сульфонилфторид, ИПТГ— Р-изопропилтиогалактозид, ПЦР — полимеразная цепная реакция, п.г. — продукт гена, н.п. — нуклеотидные пары.
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
терии в процессе инфицирования бактериофаг использует собственный структурный эндолизин для локального разрушения клеточной стенки. В конце литического цикла вирусы покидают клетку, разрушая ее, и для этого большинство литических бактериофагов содержат два поздних гена, экспрессирующих холин и эндолизин, а некоторые фаги кодируют и лизоцима-помощника, регулирующего лизис бактериальной клетки [4]. Известны также фаги, которые совсем не содержат эндолизинов, а управляют «лизисом изнутри» за счет регуляции механизмов автолиза клетки-хозяина [4—6].
Практически все бактерии, включая патогенные штаммы Streptococcus pneumoniae, Clostridium botulinum, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Salmonella typhi, Borrelia burgdorferi, имеют свои специфичные бактериофаги. Специфичность связывания и литическое действие эндолизинов фагов были изучены в целях детекции и уничтожения in vitro бактерий B. anthracis [7] и S. pneumoniae [8].
Pseudomonas aeruginosа — факультативный патоген — может вызывать длительно протекающие инфекции, часто с летальным исходом, особенно у людей со сниженным иммунитетом [9]. Мы изучаем литические бактериофаги, инфицирующие P. aeruginosa, различающиеся по
морфологии и размерам генома. Недавно завершено определение последовательности ДНК геномов трех бактериофагов, принадлежащих к различным морфологическим группам, — гигантского Myoviridae фага phiKZ [10], для которого известно несколько родственных вариантов [11], Т7-подобного Podoviridae бактериофага phiKMV [12] и фага-транспозона D3112 [13].
Геном бактериофага phiKZ содержит 280 334 нуклеотидные пары (номер в GeneBank NC-004629), кодирует не менее 300 генов, среди которых обнаружено два эндолизина — продукты генов (п.г.) 144 и 181 [10]. Ген 144 кодирует белок, содержащий 260 аминокислотных остатков (а.о.), а ген 181 кодирует большой полипептид (2237 а.о.), который вблизи С-конца содержит домен эндолизина, состоящий из 90 а.о. [14]. В данной работе представлены результаты исследования одного из эндолизинов бактериофага phiKZ п.г.144, рекомбинантная форма которого получена при экспрессии в Escherichia coli, очищена и охарактеризована.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Создание вектора и экспрессия белка. Ген 144
фага phiKZ, содержащий 780 н.п., амплифици-ровали посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием олигонуклео-тидных праймеров 144 FWD 5'-TGTAGAGGA-TCCATCATGAAAGTA и 144 REV 5'-TACATC-AAGCTTTCTATGTGCT, содержащих сайты эн-донуклеаз BamHI и HindlII соответственно. Продукт ПЦР-амплификации очищали с помощью набора Qiagen PCR, обрабатывали ферментами BamHI и HindlII, лигировали в вектор pQE-30 (Qiagen), обработанный теми же ферментами, и трансформировали в клетки E. coli Nova Blue («Novagen», США). В векторе используется сильный, хорошо регулируемый промотор фага Т5.Наличие вставки в плазмиде проверяли обработкой эндонуклеазами BamHI и HindlII и ДНК-секвенированием. Полученный плазмидный вектор, обозначенный pKZ144, продуцирующий белок п.г. 144, содержащий на ^-конце шесть остатков гистидина для аффинной очистки, трансформировали для экспрессии в клетки E. coli AD494(DE3) («Novagen»). Клетки наращивали в среде 2xYT при 37° до OD600 ~0,6, синтез белка индуцировали добавлением ß-изопропилтиогалактозида (ИПТГ) до концентрации 0,5 мМ. Затем клетки инкубировали в течение 4 ч при 37° при умеренной аэрации.
Выделение и очистка белка. Клетки E. coli из 0,5 л среды осаждали центрифугированием при 3500 об/мин в течение 15 мин, и осадок ресус-
пендировали в 30 мл буфера А (10 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 200 мМ NaCl, 1 мМ о-фенилметилсуль-фонилфторида (PMSF)). Клетки разрушали ультразвуком («Techpan» MD20, Польша, пять импульсов по 15 с), нерастворимые фрагменты клеток отделяли центрифугированием при 17 000 об/мин в течение 20 мин. Супернатант наносили на колонку с Ni-NTA-агарозой («Qiagen», США). Элюцию аффинносвязанного белка в на-тивных условиях проводили 200 мМ имидазолом в буфере А. Очищенный препарат белка диализо-вали против 20 мМ буфера Tris-HCl, pH 7,5, 50 мМ NaCl и концентрировали с помощью Amicon Centriprep 10 («Millipore», США). Концентрацию белка определяли методом Брэдфорд с помощью набора реактивов («Bio-Rad», США).
Определение олигомерности белка гель-фильтрацией. Препарат очищенного п.г. 144 наносили на колонку Superose 12 HR10/30 («Pharmacia», Швеция), уравновешенную буфером А, и элюи-ровали со скоростью 0,5 мл/мин. Предварительно колонку калибровали стандартами белков. По графику зависимости логарифма молекулярной массы белка от объема элюции определяли наблюдаемую молекулярную массу белка п.г. 144. Сравнительные площади пиков определяли с помощью программы FPLC Manager.
Спектр кругового дихроизма (КД). Его снимали с помощью спектрополяриметра J-500 («JASCO», Япония) в 10 мM Na-фосфатного буфера, pH 7,5, при комнатной температуре. Содержание вторичной структуры рассчитывали методом Провенчера [14] c использованием программ CONTIN [15] или Selcon [16].
Определение активности белка. Для определения ферментативной активности (на различных стадиях очистки или при хранении белка) кружок стерильной фильтровальной бумаги диаметром 5 мм, смоченный раствором белка (0,01—0,4 мг/мл), помещали на газон клеток P. аeruginosa РАО 1, обработанных парами хлороформа. Активный белок при инкубации в течение 20—30 мин при 37° образовывал на газоне просветленную зону.
Иммунизация. Самок мышей линии BALB/cJ иммунизировали внутрибрюшинно трехкратно с двухнедельными интервалами. Животным вводили суспензию, содержавшую 50—100 мкг рекомбинантного п.г. 144 в 0,2 мл фосфатно-со-левого буфера и 0,2 мл полного адъюванта Фрейнда при первой иммунизации или 0,2 мл неполного адъюванта при последующих имму-низациях. На седьмой день после второй или последующих иммунизаций отбирали кровь.
Иммуноблоттинг. Белки разделяли с помощью Ds-Na-ПААГ [17] и переносили на нитро-целлюлозную мембрану («Novex»), использовав
0,1 М Tris-боратный буфер, 0,05 М ЭДТА, рН 8,3 [18]. Мембрану инкубировали 1 ч в растворе 1%-ного бычьего сывороточного альбумина (БСА) в фосфатно-солевом буфере, содержавшем 0,05% Твин-20 (ФСБ-Т) при 20° для исключения неспецифической сорбции, инкубировали в течение 1 ч при 20° с сывороткой, а затем в тех же условиях — с антимышиными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. На каждой стадии мембрану промывали не менее 5 раз ФСБ-Т. Комплексы белок—антитело—фермент окрашивали 0,02%-ным раствором 3',3-ди-аминобензидина («Sigma»,США).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Анализ последовательности п.г. 144. На рис. 1, а представлена аминокислотная последовательность п.г. 144, рассчитанная на основе последовательности гена [10]. Поиск гомологий в системах BLAST [19] и CDD [20] показал высокое сходство С-концевой части последовательности п.г. 144 (остатки 92—181) с литическими трансгли-козилазами. Эти ферменты относятся к той же группе N-ацетилмурамоилгидролаз (ЕС 3.2.1.17), что и лизоцимы. Они действуют на один и тот же участок субстрата, расщепляя пептидоглика-ны клеточной стенки бактерии по р-1,4-глико-зидной связи между N-ацетилмурамовой кислотой (MurNAc) и N-ацетилглюкозамином (GlcNAc).
Однако у трансгликозилаз механизм реакции отличается от механизма действия лизоцимов образованием интермедиата 1,6-ангидро-М-МигМАс [21]. Это отличие обусловлено отсутствием в активном центре фермента одного из отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Так, если у яичного лизоцима протони-рованный остаток Glu35 служит ката
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.