БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 4, с. 556 - 567
УДК 577.152,577.113,579.252
СВОЙСТВА ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ И ГОМОГЕННЫХ ФЕРМЕНТОВ ЭНДОГЛЮКАНАЗЫ EG2 Penicilium verruculosum И ЭНДОГЛЮКАНАЗЫ LAM Myceliophtora thermophila
© 2015 Д.А. Мерзлов1*, И.Н. Зоров12, Г.С. Доценко2, Ю.А. Денисенко2, А.М. Рожкова2, А.Д. Сатрутдинов2, Е.А. Рубцова2, Е.Г. Кондратьева2, А.П. Синицын1,2
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва; факс: +7(495)932-8846, электронная почта: dmitriymerzlov@gmail.com 2 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва; факс: +7(495)954-2732, электронная почта: inbi@inbi.ras.ru
Поступила в редакцию 25.11.14 После доработки 30.12.14
Гены двух Р-глюкан-эндодеполимераз EG2 (36,2 кДа) Pénicillium verruculosum и LAM (30,8 кДа) Mycelyophtora thermophila были успешно клонированы в P. verruculosum, получены и охарактеризованы ферментные препараты (ФП), имеющие высокую активность по Р-глюкану и ламинарину, а также высокую стабильность Р-глюканазной активности. Выделены и охарактеризованы гомогенные ферменты EG2 (классифицирован как КФ 3.2.1.4) и LAM (классифицирован как КФ 3.2.1.6). Значение Km EG2, определенной по Р-глюкану, была в ~10 раз выше, чем у LAM, однако EG2 обладала большей процессивностью за счет более высокого значения kcat. Диапазоны оптимальных рН и температур EG2 и LAM перекрывались и составляли 4,3—4,9 и 61—67°, при этом EG2 оказалась более стабильной, чем LAM. Показано, что в результате гидролиза Р-глю-кана и ламинарина исследуемыми ферментами образуются олигосахариды со степенью полимеризации от 2 до 10. Установлено, что полученные рекомбинантные ФП при одинаковой дозировке с коммерческими ФП обеспечивали более быстрое и более существенное уменьшение приведенной вязкости цельнозерново-го экстракта ячменя, что делает их перспективными для использования их в качестве кормовой добавки для разрушения некрахмальных полисахаридов зерна.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: эндоглюканаза, Р-глюкан, Р-глюкан-эндодеполимеразы, ферментные препараты, Penicillium verruculosum, Myceliophtora thermophila.
Злаковые культуры (овес, рожь, ячмень, пшеница и др.) широко применяются для производства кормов, используемых в животноводстве. Однако эти источники питательных веществ содержат некрахмальные полисахариды (НПС), которые отрицательно влияют на переваримость корма [1]. Попадание растворимых НПС с кормами в желудочно-кишечный тракт моногастричных животных (домашняя птица) приводит к образованию вязких желеобразных субстанций, которые затрудняют доступ пищеварительных соков к питательным веществам, ухудшая их усвояемость [1, 2].
Основным НПС ячменя и овса являются р-глю-каны, представляющие собой умеренно растворимые в воде линейные полисахариды, в которых остатки Б-глюкопиранозы соединены 1,3-0-
* Адресат для корреспонденции.
и 1,4-р-гликозидными связями. Общее содержание НПС в сухом веществе ячменя и овса обычно составляет 3,7—7,0 и 3,0—6,0% соответственно [2, 3].
Ферменты, способные гидролизовать различные р-глюканы по неупорядоченному механизму, называют р-глюкан-эндодеполимераза-ми и относятся к под-подклассу гликозил-гид-ролаз (КФ 3.2.1.Х). В настоящее время известно четыре группы представителей данного под-подкласса таких ферментов: целлюлазы (3.2.1.4), лихеназы (3.2.1.73), эндо-1,3(4)-р-глюканазы (3.2.1.6) и ламинариназы (3.2.1.39) (http://www. brenda-enzymes.org/).
Использование в кормопроизводстве ФП Р-глюканаз позволяет уменьшить вязкость содержимого кишечника моногастричных животных и, тем самым, повышает усвояемость питательных веществ [1].
Цель данной работы — получение и изучение свойств новых рекомбинантных ФП с увеличенной ß-глюканазной активностью, полученных на основе реципиентного штамма мицелиаль-ного гриба P. verruculosum, а также изучение свойств индивидуальных эндоглюканаз с высокой ß-глюканазной активностью — эндоглюка-назы EG2 (P. verruculosum) и эндоглюканазы LAM (M. thermophila).
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Субстраты. Для определения активностей ФП и очищенных ферментов использовали следующие субстраты: и-нитрофенил^^-глюко-пиранозид (пHФГ), глюкуроноксилан березы (ксилан), Na-соль карбоксиметилцеллюлозы (KМЦ), ламинарин, курдлан («Sigma», США); микрокристаллическую целлюлозу (MKU|, ООО «MK-Центр», Россия), дополнительно обработанную на шаровой мельнице АГО-2 (ОАО «Восточно-сибирский комбинат биотехнологий», Россия); ß-глюкан ячменя («Megazyme», Ирландия).
Прочие реактивы. Для приготовления реагентов Шомоди—Hельсона, Лоури и буферных растворов использовали реактивы марок х.ч., ч.д.а. и ос.ч. производства «АО Реахим» (Россия), «MP Biomedicals Inc.» и «Sigma» (США).
Для проведения ферментаций использовали глюкозу («Roquette Pharma», Франция), пшеничные отруби (ООО «Энзим», Украина), MKU| (ООО «MK-Центр», Россия), дрожжевой экстракт («Lesaffre», Франция).
В качестве минеральных компонентов питательных сред использовали реактивы производства «Лабтех» (Россия), «АО Реахим» (Россия), «Химмед» (Россия), «MP Biomedicals Inc.» и «Sigma» (США).
Проведение ПЦР и получение генетических конструкций. Для проведения ПЦР был использован амплификатор «^уСу^о» («Bio-Rad», США). Для амплификации генов egl2 или lamí использовали в качестве матрицы геномную ДHK, выделенную из мицелия штаммов P. verruculosum и M. thermophila соответственно. Для проведения ПЦР использовали смесь высокоточной и процессивной полимераз — long poly-merase mix, 10 x long polymerase PCR buffer + MgCl2 и dNTP mix («Thermo Scientific», США). ПЦР проводили при следующих условиях: первичная денатурация проходила при 95° 5 мин; денатурация в цикле при 95° 1,5 мин; отжиг праймеров в течение 1 мин при 52°; элонгация в течение 1,5—2 мин (в зависимости от длины полинуклео-тидной последовательности гена) при б8°, 25 цик-
лов. ПЦР с использованием плазмидной ДHK проводили по схеме: первичная денатурация проходила при 95° 45 с; денатурация в цикле при 95° 30 с; отжиг при 50—55° 1 мин; элонгация при 68° 1,5—2 мин в зависимости от длины полинук-леотидной последовательности гена, 20—25 циклов.
Полученный ПЦР-продукт был клонирован методом независимого лигирования [4]. ПЦР-продукт выделяли из агарозного геля и очищали, используя набор реагентов фирмы «QIAGEN» (Германия) в соответствии с методикой фирмы-производителя. Далее ПЦР-продукт и линеаризованный вектор pUC-CBHI обрабатывали Т4-ДHK полимеразой («Thermo Scientific», США) в присутствии деоксиаденозинтрифосфата dATP и деокситимидинтрифосфата dTTP («Thermo Scientific», США) в течение 30 мин при 22° [4]. Обработанная вставка была лигирована в pUC-CBHI вектор, полученный ранее [5], путем смешивания 50 нг вектора и 150 нг вставки. Смесь инкубировали 30 мин при 22°, после чего трансформировали в клетки E. coli MACHI («Invitrogen», США) по стандартному протоколу трансформации, описанному в лабораторных протоколах [6].
Скрининг трансформантов. Трансформанты P. verruculosum культивировали в колбах Эрлен-мейера при 30° в течение б сут, объем ферментационной среды — 100 мл. Среда включала следующие компоненты (в г/л): MKU| — 40, пшеничные отруби — 10, дрожжевой экстракт — 10, глюкоза - 10, KH2PO4 - 15, (NH4)2SO4 - 5, MgSO4 ■ ■ 7H2O - 0,3, eáClj ■ 2H2O - 0,3. Отбор трансформантов осуществляли по результатам исследования культуральной жидкости (ЕЖ) с помощью Ds-Na-ПААГ-электрофореза и измерения активностей по полисахаридным субстратам (KM^ ß-глюкан и ламинарин). Ds-Na-ПААГ-электрофорез проводили на приборе Model 3000Xi c MiniPratean Tetra Cell («Bio-Rad Laboratories», США), руководствуясь методикой производителя. Окраску белка в гелях производили красителем Coomassie-Brilliant Blue R-250 («Ferak», Германия). В качестве стандарта для ПААГ-Ds-Na-электрофореза использовали смеси белков #2бб12 (20-120 кДа) производства «Thermo Scientific» (США). ^н^трацию белка определяли с помощью модифицированного метода Лоури, используя БСА в качестве стандарта [7, 8], или по оптическому поглощению образцов при 280 нм. Измерения проводили, используя спектрофотометр Cary 50-Scan («Varian», США).
Определения активности ФП и очищенных ферментов. Активность по полисахаридным субстратам (MKU|, KM^ ксилан, ß-глюкан, ла-минарин, курдлан, лихенан) определяли по начальным скоростям образования восстанавли-
вающих сахаров (ВС), используя модифицированный метод Шомоди—Нельсона [9]. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль ВС в мин, рН 5,0, при концентрации субстрата 5 г/л и температуре 50° (в случае МКЦ — 40°).
Целлобиазную (ß-глюкозидазную) активность определяли, используя пНФГ в качестве субстрата, измеряя начальную скорость образования «-нитрофенола [10]. За единицу активности принимали количество фермента, необходимое для образования 1 мкмоль «-нитрофенола при рН 5,0 и 40° за 1 мин.
Наработка ФП. Культивирование рекомби-нантных штаммов осуществляли в трехлитровых ферментерах фирмы «ПроИнтех» (Россия) в течение 144 ч при 30° на ферментационной среде того же состава, который использовали при культивировании трансформантов в колбах. По окончании ферментации КЖ центрифугировали при 4000 об/мин в течение 1 ч на центрифуге Avanti J6-MI («BeckmanCoulter», США). Полученный супернатант подвергали ультра-концентрированию при 4° на мембране Biomax 5K, картридж Pellicon XL 50 («Millipore», США), концентраты были заморожены при температуре —70° и лиофильно высушены на лиофильной сушке Benchtop 9L ES («VirTis», США).
Фракционирование ФП и выделение эндоглю-каназ. Выделение эндоглюканаз P. verruculosum и M. thermophila осуществляли в три этапа: обес-соливание ФП, анионообменная хроматография (АОХ) ферментного комплекса и гидрофобная хроматография (ГФХ). Все стадии фракционирования и очистки осуществляли с использованием хроматографической системы AKTA UPC («GE Healthcare», Швеция), которая состояла из автоматического контроллера, насосов, ультрафиолетового проточного детектора, кондуктометра и коллектора фракций.
Предварительно растворенные в 0,01 M Na-ацетатном буфере, pH 5,0, ФП обессоливали на колонке с носителем BioGel Р2 (
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.