БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 2, с. 216 - 222
УДК 541.127/128
СВОЙСТВА ГЕКСАГИСТИДИНСОДЕРЖАЩЕЙ ОРГАНОФОСФАТГИДРОЛАЗЫ
© 2006 г. Ю.А. Вотчицева, Е.Н. Ефременко*, Т.К. Алиев, С.Д. Варфоломеев
Химический факультет, МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва; факс: (495)939-5417, электронная почта: efremenko@enzyme.chem.msu.ru
Поступила в редакцию 27.01.05 После доработки 22.02.05
Изучены каталитические характеристики полученной нами ранее органофосфатгидролазы (ОРН), содержащей гексагистидиновую последовательность His6-OPH, и проведена очистка белка до 98% гомогенности. Показано, что рН-оптимум ферментативной активности и изоэлектрическая точка His6-OPH смещены в щелочную область по сравнению с нативной ОРН и составляют 10,5 и 8,5 соответственно. Модифицированный белок обладает улучшенными каталитическими характеристиками по отношению к S-содержащим субстратам: каталитическая эффективность гидролиза метилпаратиона составляет 4,2 • 106, а для нативной ОРН 3,5 • 105М-1- с-1.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: органофосфатгидролаза, гибридные белки, гексагистидиновая последовательность, фосфорорганические пестициды, субстратная специфичность.
Реальную угрозу для здоровья людей представляют различные фосфорорганические пестициды, обладающие острой и кумулятивной ней-ротоксичностью [1—4]. С развитием биотехнологии все большую популярность находят ферментативные способы детекции и деструкции этих соединений, в частности, с применением органофосфатгидролазы (ОРН, арилдиалкил-фосфатаза, фосфотриэстераза, ЕС 3.1.8.1) — фермента, осуществляющего гидролиз фосфор-органических соединений (ФОС), содержащих Р—О, Р—Б и Р—8 связи в триэфирах ортофос-форной кислоты [5].
Потребность в промышленном получении ОРН определяется возможностью использования этого фермента в качестве каталитически активного элемента биосенсорных устройств, предназначенных для определения ФОС в различных объектах (продуктах питания, речных и сточных водах) [6, 7]. В настоящее время в мире активно разрабатываются методы биологической деградации ФОС, в том числе с применением ОРН [8, 9]. Чтобы такие методы нашли свое применение на практике, необходимы технологически реализуемые, экономически оправданные, высокоэффективные способы получения фермента. Как правило, такие способы предполагают увеличение уровня синтеза фермента за
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
счет оптимизации условий культивирования ре-комбинантных штаммов-продуцентов ОРН и оптимизации процессов выделения и очистки белка с минимальным количеством стадий.
Используемый в настоящее время процесс выделения и очистки ОРН, состоящий из пяти последовательных стадий [10], является трудоемким, длительным и потому нетехнологичным. Создание генетической конструкции для экспрессии рекомбинантного белка, содержащего дополнительно введенную гексагистиди-новую последовательность (И186), может обеспечить получение высокоочищенного фермента за две технологические стадии при использовании металл-хелатирующей хроматографии [11, 12]. Данный подход к выделению и очистке белка основан на образовании аффинного комплекса между И^6 белка и ионами металла, которым заряжен хроматографический носитель, модифицированный хелатирующими лигандами [13].
В большинстве случаев введение И186 в состав молекулы белка не оказывает влияния на его каталитические свойства [14—16]. Данный факт обусловливает популярность указанного подхода на практике для эффективного выделения ре-комбинантных белков. Однако из литературных данных известно, что в некоторых случаях такая модификация белка может изменять свойства целевого белка, в частности, каталитические характеристики фермента [17, 18], растворимость
[19] и способность образовывать олигомеры
[20]. Кроме того, может снижаться уровень модифицированного белка в активной растворимой форме за счет образования телец включения [21].
Все вышеперечисленные обстоятельства явились основанием для получения генетических конструкций, обеспечивающих высокий уровень синтеза нативной ОРН и содержащей His6 на N-конце молекулы белка (His6-OPH) [22—24]. Был подобран штамм Escherichia coli, оптимальный для максимального уровня накопления His6-OPH в растворимой форме [23]. Модифицированный белок был выделен и очищен на Ni-NTA-агарозе до 98% степени гомогенности [24].
Настоящая работа посвящена изучению следующих каталитических свойств модифицированного белка His6-OPH: субстратной специфичности, рН-оптимума действия и температурным зависимостям активности фермента. Также в работе проведено сравнение свойств на-тивной и модифицированной ОРН.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали параоксон (диэтил-и-нитрофенилфосфат), паратион (диэтил-и-нит-рофенилтиофосфат), имидазол, Ches (2-[N-циклогексил-амино]этансульфоновая кислота, Hepes 4- [2-гидроксиэтил] -1 -пиперазинэтан-сульфоновая кислота, хлорид кобальта шести-водный, хлорид никеля, глицерин, бромфено-ловый синий, кумасси бриллиантовый синий R-250, натриевая соль ампициллина, дисульфат канамицина, яичный альбумин, додецилсуль-фат натрия («Sigma», США); метилпаратион (диметил-и-нитрофенилфосфат) («Fluka», Швейцария); триптон, дрожжевой экстракт («Difco», США); акриламид, бисакриламид, этилендиа-минтетрауксусная кислота (ЭДТА) («Merck», Германия); изопропил- ß-D-тиогалактопирано-зид (ИПТГ), маркеры для белкового электрофореза с молекулярными массами 14,4; 18,4; 25,0; 35,0; 45,0; 66,2; 116,0 кДа («Fermentas», Литва); ^^№,№-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), персульфат аммония («Bio-Rad», США). В качестве носителя для аффинной хроматографии использовали Ni-NTA-агарозу (агароза, модифицированная нитрилотриуксусной кислотой) («Qiagen», США). Все остальные использованные в работе реактивы марки ч.д.а. были приобретены в фирмах «Лабтехника» и «Химмед» (Россия).
Для трансформации клеток E. coli были использованы следующие генетические конструк-
ции: pTES-OPH (с клонированным геном oph из клеток Pseudomonas diminuta ВКМ B-1297) и pTES-His-OPH (для экспрессии ОРН, содержащей гексагистидиновую последовательность на N-конце молекулы белка), полученные в соответствии с [22, 24]. Для выделения нативной и модифицированной ОРН использовали клетки E. coli DH5a и E. coli SG13009[pREP4] соответственно.
Культивирование клеток E. coli DH5a проводили при 37° на LB среде с ампициллином (100 мкг/мл), а штамм SG13009[pREP4], содержащий плазмиду pTES-His-OPH, культивировали на среде LB, содержащей одновременно ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл). 16-Часовой инокулят вносили в колбу, содержавшую 100 мл питательной среды следующего состава: триптон — 12,0 г/л, дрожжевой экстракт — 24,0 г/л, глицерин - 4,0 г/л, KH2PO4 - 6,95 г/л, K2HPO4 ■ 3H2O - 12,54 г/л fcH 7,0). При достижении поглощения ^540 0,6 индуцировали синтез фермента введением в среду ИПТГ до конечной концентрации 0,25 мМ. Одновременно в среду вносили раствор CoCl2 до конечной концентрации ионов Co2+ 10-4 М. Культивировали клетки при 30° и постоянном перемешивании (200 об/мин) на термостатируемой качалке Adolf Kuhner AG (Швейцария) в течение 21-24 ч. Далее биомассу отделяли от среды центрифугированием (5000 g, 20 мин) на центрифуге Beckman J2-21 (США).
Выделение и очистку нативной ОРН проводили в соответствии с известной методикой [23], согласно которой из 1 г биомассы клеток получали 12 мг целевого белка со средней удельной активностью 5820 ед/мг. Выход фермента составлял 69% от исходного количества OPH, синтезированного клетками.
Выделение и очистку His6-OPH проводили на Ni-NTA-агарозе. Влажную биомассу взвешивали и ресуспендировали в 50 мМ фосфатном буфере, рН 8,0, содержавшем 300 мМ NaCl, до концентрации 0,2 г/мл. Далее суспензию клеток обрабатывали ультразвуком (частота 44 кГц) 6 раз по 45 с. Полученную массу отделяли центрифугированием (15 000 g, 30 мин). К супернатанту добавляли равный объем суспензии Ni-NTA-агарозы, предварительно уравновешенной в 50 мМ фосфатном буфере. Полученной суспензией заполняли хроматографическую колонку (5 мл), которую промывали 50 мМ фосфатным буфером (рН 8,0), содержавшем 300 ммолей NaCl и 10 ммолей имидазола, со скоростью 0,5 мл/мин до достижения поглощения ^280 0,01. Фермент элюировали градиентом раствора имидазола (10-500 мМ). Имидазол из собранных фракций удаляли диализом против 50 мМ фосфатного бу-
фера (рН 8,0), затем электрофоретически анализировали фракции и определяли концентрацию белка и ферментативную активность. В результате очистки из 1 г влажной биомассы получали 5,2 мг высокоочищенного ферментного препарата со средней удельной активностью 6870 ед/мг белка. Выход фермента составлял 81,7% от исходного количества His6-OPH, синтезированного клетками.
Уровень синтеза OPH и His6-OPH, а также гомогенность ферментных препаратов оценивали электрофоретически в денатурирующих условиях в 12% полиакриламидном геле с использованием ячейки Miniprotean II «Bio-Rad» (США) с последующим окрашиванием кумасси R-250.
Концентрацию белка определяли методом Брэдфорд с применением реагента фирмы «Bio-Rad».
Изоэлектрические точки белков определяли с помощью аналитического изоэлектрофокуси-рования (ИЭФ) на приборе Model 111 Cell («Bio-Rad»).
При обработке всех экспериментальных данных рассчитывали средние значения и значения стандартного отклонения. Все эксперименты проводились в трех повторностях.
Определение активности ОРН и His6-OPH. Ферментативную активность определяли спект-рофотометрически с использованием спектрофотометра Agilent 8453-UV (Германия) при 25°, следя за накоплением продукта гидролиза 4-нит-рофенолят-аниона при 405 нм; (в 17 000 М-1 см-1, рН 9,0; в 18 000 М-1 см-1, рН 10,5). Для определения каталитической активности ОРН и His6-OPH использовали 50 мМ Ches буфер (рН 9,0) и 50 мМ карбонатный буфер (рН 10,5) соответственно. Для исследования субстратной специфичности ферментов использовали 1 мМ водные растворы параоксона, паратиона и метил-паратиона. Каталитическую реакцию инициировали внесением раствора ОРН или His6-ОРН в кювету с буфером и субстратом так, чтобы концентрация каждого из ферментов в реакционной среде составляла 10-10—10-9 М (£0).
За единицу
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.