ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 2, с. 178-183
УДК 577.152.3:595.384.2
СВОЙСТВА ХИТИНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ГЕПАТОПАНКРЕАСА КАМЧАТСКОГО КРАБА Paralithodes camtschaticus
© 2007 г. В. Ю. Новиков*, В. А. Мухин*, К. С. Рысакова**
*Полярный научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н. М. Книповича (ПИНРО), г. Мурманск, 183763; e-mail: nowit@pinro.ru **Мурманский государственный технический университет, г. Мурманск, 183010
Проведенные исследования подтверждают присутствие в гепатопанкреасе камчатского краба хити-назной, хитозаназной, а также деацетилазной активности, что связано с особенностями состава пищи этого вида. С максимальной скоростью гидролиз хитина/хитозана под действием ферментного препарата из гепатопанкреаса краба протекает при температуре 36.5-37.0°С. Определено два рН-оптимума ферментативного процесса при слабощелочных и кислых условиях как для экзо-, так и для эндохитиназной активности. Изученный ферментный препарат имеет максимальное субстратное сродство по отношению к частично деацетилированному хитину со степенью ацетилирования около 40-50%.
Помимо широко распространенных ферментов, гидролизующих основные биополимеры, в пищеварительном тракте некоторых видов животных выявлены гидролазы, расщепляющие такие компоненты, как хитин, целлюлоза и другие трудногидролизуемые полисахариды. Наиболее подробно изучены хитиназы, обнаруживаемые преимущественно у видов, в пищевой спектр которых входят организмы с хитиновым покровом [1].
Изучение хитиназ и других ферментов, расщепляющих хитин и его производные, актуально в трех основных аспектах. Во-первых, исследование хитиназной активности ракообразных имеет большое значение для изучения их физиологического состояния, так как хитиназы, помимо расщепления хитина, содержащегося в пище, участвуют в процессе смены панциря (линька). Во-вторых, хитиназы представляют интерес для технологии модификации хитина и хитозана с целью получения производных, в частности олигосахаридов, проявляющих высокую фармацевтическую и биологическую активность. В-третьих, хитиназы составляют действующее начало препаратов для борьбы с вредителями сельскохозяйственных растений, животных, для лечения грибковых заболеваний у людей, в косметических средствах и т.д.
В процессе переработки камчатского краба на пищевую продукцию образуются отходы, в частности гепатопанкреас, который представляет интерес как источник различных ферментов, например протеолитических [2]. Ранее нами была обнаружена хитинолитическая активность ферментных препаратов, выделенных из гепатопанкреаса краба [3, 4].
Цель работы - изучение свойств хитинолити-ческих ферментов гепатопанкреаса камчатского краба.
МЕТОДИКА
В качестве объекта исследования использовали гепатопанкреас камчатского краба Paralithodes camtschaticus и ферментный препарат, полученный из него [5]. Субстратом служили хитин (ХТН) и хитозан (ХЗН) из панциря северной креветки Pandalus borealis, полученные по известной технологии [6]. Массовая доля золы (на сухое вещество) в образце хитина и образцах хитозана -менее 0.1%, массовая доля веществ, нерастворимых в 2%-ной CH3COOH в образцах хитозана - менее 0.3%. Средневязкостные молекулярные массы и степени ацетилирования образцов хитозана приведены в таблице.
Эндохитиназную активность (£эндо) ферментов гепатопанкреаса краба определяли по изменению оптической плотности суспензии коллоидного хитина при 700 нм [7], экзохитиназную (Еэкзо) - по высвобождению N-ацетилглюкозамина (АцГлА) в ходе гидролиза субстрата [8].
Коллоидный хитин был приготовлен из креве-точного хитина по методике, изложенной в работе [7], путем переосаждения в концентрированной HCl. Коллоидный хитозан получен переосаждением в 0.1 н. HCl.
В большинстве экспериментов условия инкубации были следующие: pH 6.53 ± 0.1, температура 37 ± 0.2°C, время инкубации 30 мин, концентрация коллоидного хитина Схтн 40 мг/мл, концентрация ферментного препарата Сф 2 мг/мл. В случае исследования определенных зависимостей (темпе-
Молекулярная масса, степень полимеризации и степень ацетилирования образцов хитозана с различной начальной степенью ацетилирования до и после ферментативного гидролиза
Препарат ХЗН-1 ХЗН-2
ММ, кДа СП СА, % ММ, кДа СП СА, %
Исходный 329 ± 44 1873 35.2 ± 1.1 280 ± 46 1694 17.2 ± 2.5
Ферментированный 274 ± 52 1561 30.6 ± 2.6 241 ± 58 1435 12.2 ± 2.4
Относительное изменение, % 16.7 16.7 13.1 15.3 14.7 29.1
ратура, рН и продолжительность инкубации, концентрация ферментного препарата), изучаемые параметры варьировали.
Степень деацетилирования (СД) хитозана в процентах (%) определяли потенциометрическим титрованием 1%-ного раствора хитозана в 0.1 н. НС1, 0.1 н. №ОН [9]. Степень ацетилирования (СА) рассчитывали по формуле:
СА = 100 - СД.
Средневязкостную молекулярную массу (ММ) рассчитывали по уравнению Марка-Хаувика-Куна:
[П] = КММа,
где [п] - характеристическая вязкость хитозана в системе 0.334 М СН3ООН и 0.3 М №С1, дл/г, К = = 3.41 х 10-3, а = 1.02 [10].
Расчет молекулярной массы визкозиметриче-ским методом позволяет вычислить некоторую интегрированную величину - средневязкостную молекулярную массу (ММ), которая близка по значению к среднемассовой молекулярной массе [11, 12]. Используя это допущение, мы оценили степень полимеризации (СП) образцов хитозана по формуле:
СП =
ММ х 103 х 100
203.2 х СА + 161.2 х (100 - СА)'
ских кривых (рис. 16) показывает, что они могут быть представлены линейными зависимостями, указывающими на первый (или псевдопервый) порядок ферментативной реакции гидролиза хитина.
Преобразование к линейной зависимости, исходя из предположения о первом (псевдопервом) порядке реакции [13], приводится на рис. 2. Константы реакций первого порядка составили для эндохитиназной активности к = 0.0337 мин1, для экзохитиназной активности к = 0.0978 мин1.
На рис. 3 а приведены кривые температурной зависимости эндо- и экзохитиназной активности. Наблюдаемые оптимумы совпадают, хотя скорость дезактивации экзохитиназной активности заметно выше, чем таковая эндохитиназной активности. Оптимальной температурой для прояв-
мг/мл 6
где ММ - средневязкостная молекулярная масса, кДа; СА - степень ацетилирования хитина (хитозана), %; 203.2 и 161.2 - молекулярные массы аце-тилированного и деацетилированного мономерного звена хитина (хитозана) соответственно, Да.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Были изучены зависимости хитинолитической активности ферментов от продолжительности и температуры инкубации, концентрации фермента и рН реакционной смеси.
Кривая зависимости хитинолитической активности от времени инкубации имеет типичную для большинства ферментативных реакций экспоненциальную форму (рис. 1а). Кривые эндо- и экзохитиназной зависимости практически совпадают при сопоставимых масштабах осей ординат. Полулогарифмическое преобразование кинетиче-
0 18
10 мин
Рис. 1. Зависимость активности фермента от времени инкубации (а), то же в полулогарифмических осях (б). 1 - эндохитиназная активность, %, 2 - экзохитиназная активность, мг/мл, рН 6.5, 37°С, Схтн = 40 мг/мл, Сф = 2 мг/мл, время инкубации, мин.
ln(16.5 - Еэндо) 3
ln(4.9 - ЕЭкзо) -| 2
0
-2 -4
30 мин
Рис. 2. Преобразование кинетических кривых к линейному виду, исходя из предположения о первом порядке реакции. 1 - эндохитиназная активность 1п(16.5 - -Еэндо), 2 - экзохитиназная активность 1п(4.9 -- Еэкзо), время инкубации, мин.
ления ферментативной активности в обоих случаях является 36.5-37.0°С.
Следует отметить, что определенный нами [14] и другими авторами [15-17] температурный оптимум для проявления протеолитической активности по отношению к казеинату натрия и гемоглобину составляет около 55°С.
При определенном повышении температуры реакционной смеси происходит тепловая денатурация белковых молекул, причем как фермента, так и субстрата, а денатурированные белки, как известно, легче поддаются протеолитическому расщеплению. В случае определения хитинолити-ческой активности денатурации при высокой температуре подвергаются только молекулы фермента, а хитин сохраняет свою структуру. Возможно, именно этим объясняется полученное расхождение при определении температурных оптимумов хити-нолитической и протеолитической активности.
По-видимому, при определении этого параметра для ферментов следует учитывать условность самого понятия "температурный оптимум фермента", так как он зависит не только от свойств самого фермента, но и в не малой степени от особенностей используемого субстрата.
В ферментологии оптимумом рН считают значение рН (или интервал значений рН), при котором достигается максимальная активность фермента (максимальная скорость реакции). Зависимости эндо- и экзохитиназной активности от рН имеют по два максимума (рис. 36). Максимумы в слабощелочной области при рН около 7.9 совпадают, а максимумы в кислой - несколько отличаются. Присутствие в одном органе ферментов, способных расщеплять один и тот же субстрат при различных значениях рН, весьма распространено в природе, и, по-видимому, является эволюционно сформировавшейся биохимической адаптацией. Для эндохитиназной активности рН-оптимум бли-
%
18 15 12
9 6 3
20 16 12 8 4 0
(а)
мг/мл 6
5
4
3
2
1
6
pH
Рис. 3. Зависимость активности фермента от температуры инкубации при pH 6.5 (а) и pH раствора при 37°C (б). 1 - эндохитиназная активность, %; 2 - экзохитиназная активность, мг/мл, 30 мин, Схтн 40 мг/мл; Сф 2 мг/мл.
зок к 6.0, а для экзохитиназной активности сдвинут в кислую область - около 4.3. Обнаруженное отличие позволяет считать, что за эти два вида активности, по-видимому, отвечают различные ферменты.
Принято считать, что расщепление хитина осуществляется хитинолитическим комплексом, в который входят хитиназа (КФ 3.2.1.14) и Р-аце-тилгексозаминидаза (КФ 3.2.1.52) [1, 18].
Хитиназа (поли[1,4-(К-ацетил-Р-Б-глюкозами-нид)]глюканогидролаза, КФ 3.2.1.14) осуществляет случайный гидролиз 1,4-Р-связей между К-аце-тил-Р-Б-глюкозаминными звеньями полимерной цепи хитина. Этот эндофермент расщепляет хитин до олигомеров, включая К-ацетилхитобио
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.