ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2010, том 36, № 5, с. 638-645
УДК 577.112.6.017
СВОЙСТВА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ СИНТЕТИЧЕСКОГО
ПЕПТИДА ОКТАРФИНА
© 2010 г. Ю. Н. Некрасова*, В. Б. Садовников*, Ю. А. Золотарев**, Е. В. Наволоцкая*#
*Филиал Учреждения РАН Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
142290, Московская обл., г. Пущино, просп. Науки, 6;
**Учреждение РАН Институт молекулярной генетики, Москва Поступила в редакцию 23.12.2009 г. Принята к печати 25.01.2010 г.
Синтезированы пептид TPLVTLFK, аминокислотная последовательность которого соответствует фрагменту 12—19 ß-эндорфина (авторское название — октарфин), и его аналоги (LPLVTLFK, TLLVTLFK, TPLVLLFK, TPLVTLLK, TPLVTLFL). Получен меченный тритием октарфин (уд. акт. 28 Ки/моль) и изучено его связывание с перитонеальными макрофагами мыши. Установлено, что [3Н]октарфин связывается с макрофагами с высокой аффинностью (Kd 2.3 ± 0.2 нМ) и специфичностью: специфическое связывание [3Н]октарфина с макрофагами ингибировали немеченые ß-эндорфин и селективный агонист неопиоидного рецептора ß-эндорфина синтетический пептид иммунорфин (SLTCLVKGFY) (K¡ 2.7 ± 0.2 и 2.4 ± 0.2 нМ соответственно) и не ингибировали немеченые налоксон, а-эндорфин, у-эндорфин и [Ме^энкефалин (K¡ > 10 мкМ). Ингибирующая активность аналогов октарфина была в 100 и более раз ниже, чем у октарфина. Показано, что октарфин стимулирует активность иммунокомпетентных клеток мыши in vitro и in vivo: при концентрации 1—10 нМ он увеличивал адгезию и распластывание перитоне-альных макрофагов, а также их способность переваривать бактерии вирулентного штамма Salmonella ty-phimurium 415 in vitro; внутрибрюшинное введение пептида (20 мкг/животное за 7, 3 и 1 сутки до выделения клеток) приводило к возрастанию активности перитонеальных макрофагов, а также T- и В-лимфо-цитов селезенки.
Ключевые слова: ß-эндорфин, пептиды, налоксон, рецепторы, иммунная система.
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что эндогенный нейропептид Р-эндорфин (УООРМТ8ЕК8дТРЬУТЬРКМЛ1-¡КМАУККОЕ), помимо опиоидных ц- и 8-рецеп-торов [1], связывается с впервые описанным Хей-зум и соавт. [2] неопиоидным (не чувствительным к опиоидному антагонисту налоксону) рецептором. В 1980 г. Джулиард и соавт. в составе тяжелой цепи 1§С человека обнаружили последовательности, подобные последовательностям кортикотропина и Р-эн-дорфина [3]. Затем Хоук и соавт. синтезировали тет-радекапептид 8ЬТСЬУКОРУР8В1, соответствующий Р-эндорфинподобной последовательности 1§С (фрагмент 364—377 Сн3-домена тяжелой цепи) и показали, что он конкурирует с 1251-меченным Р-эндорфином за связывание с мембранами головного мозга крысы [4].
Позднее нами был синтезирован и исследован Р-эндорфинподобный декапептид 8ЬТСЬУКОРУ (авторское название — иммунорфин), соответствующий последовательности 364—373 тяжелой цепи
Сокращения: СопА — конканавалин А; ЛПС — липополи-сахарид.
# Автор для связи (тел.: (27) 73-66-68; факс: (27) 33-05-27; эл. почта: navolots@fibkh.serpukhov.su).
IgG(1—4) человека [5]. Эксперименты показали, что меченный йодом-125 или тритием иммунорфин с высоким сродством и специфичностью связывается с неопиоидными рецепторами Р-эндорфина T-лим-фоцитов человека [6—9], перитонеальных макрофагов мыши [10, 11], синаптических мембран головного мозга крысы [12], а также клеток человеческой T-лимфобластной линии Jurkat [13]. Исследование c помощью [3Н]иммунорфина распределения неопиоидного рецептора Р-эндорфина в организме крысы показало, что он имеется на клетках иммунной (макрофаги и лимфоциты), нервной (синап-тические мембраны головного мозга), эндокринной (мембраны коры надпочечников) и сердечно-сосудистой (мембраны миокарда) систем [14]. Изучение биологической активности иммунор-фина показало, что он увеличивает индуцированную митогеном пролиферацию T-лимфоцитов человека in vitro [6—9], активирует перитонеальные макрофаги мыши in vitro и in vivo [10, 11], стимулирует рост человеческих T-лимфобластных клеточных линий Jurkat и MT-4 [13, 15], ингибирует активность аденилатциклазы мембран коры надпочечников крысы и подавляет секрецию глюкокортикоидов из надпочечников в кровь [16], стимулирует процессы
Таблица 1. Основные характеристики синтезированных пептидов
Пептид Чистота, % Данные аминокислотного анализа Молекулярная масса*
Thr Pro Ser Gly Val Leu Tyr Phe Lys
SLTCLVKGFY (иммунорфин) >97 0.89 - 0.92 1.00 1.00 1.94 1.03 1.00 0.91 1129.3 (1130.0)
TPLVTLFK (октарфин) >97 1.96 0.97 - - 1.00 2.02 - 1.00 0.95 917.9 (918.24)
LPLVTLFK (I) >97 0.95 0.99 - - 0.99 2.98 - 0.97 0.95 930.4 (930.29)
TLLVTLFK (II) >97 1.98 - - - 0.98 2.99 - 0.98 0.97 934.4 (934.28)
TPLVLLFK (III) >97 0.99 0.98 - - 1.00 3.04 - 1.02 0.97 930.5 (930.29)
TPLVTLLK (IV) >97 1.97 0.96 - - 1.01 3.00 - - 0.98 884.6 (884.22)
TPLVTLFL (V) >97 1.98 0.98 - - 0.99 2.96 - 1.03 - 902.9 (903.22)
* Данные масс-спектрометрии (в скобках расчетное значение).
клеточного деления ранних эмбрионов мыши и образование зрелых бластоцист in vitro [17, 18].
Недавно нами с целью определения фрагмента Р-эндорфина наименьшей длины, способного с высоким сродством связываться с неопиоидным рецептором, была синтезирована панель пептидных фрагментов Р-эндорфина и исследована способность каждого из 30 пептидов ингибировать специфическое связывание [3Н]иммунорфина с пе-ритонеальными макрофагами мыши. В результате было установлено, что синтетический октапептид TPLVTLFK, соответствующий последовательности 12—19 Р-эндорфина (авторское название — ок-тарфин), является самым коротким фрагментом гормона, имеющим практически такое же сродство к неопиоидному рецептору, как иммунорфин и Р-эндорфин (К 3.1 ± 0.3 нМ) [19, 20].
Цель настоящей работы — изучение влияния ок-тарфина на активность иммунокомпетентных клеток мыши in vitro и in vivo.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Основные характеристики синтезированных пептидов — иммунорфина, октарфина и аналогов октарфина (I)—(V) (содержание целевого продукта/пептида, данные аминокислотного анализа и молекулярные массы) приведены в табл. 1.
Сравнение аминокислотных последовательностей Р-эндорфина человека, мыши и крысы показало их высокое подобие (90.3%) [21]. Полная идентичность структур на участке 12—19 свидетельствует о высокой консервативности последнего и это позволяет исследовать биологическую активность ок-тарфина на мышиных моделях.
Для исследования рецепции октарфина были синтезированы 5 его аналогов (I)—(V) (табл. 1), а также был получен [3Н]октарфин с удельной активностью 28 Ки/моль. Время удерживания [3Н]октар-фина и немеченого октарфина на колонке Kromasil С18 (условия хроматографии приведены в разделе
"Эксперимент. часть") совпадало и составляло 15 мин; отношения молярных коэффициентов поглощения при 254 и 280 нм для меченого и немеченого пептида также совпадали, что свидетельствует о сохранении химического строения иммунорфина при замещении водорода на тритий. Результаты экспериментов по связыванию [3Н]октарфина с пе-ритонеальными макрофагами мыши показали, что оно характеризуется насыщаемостью, высоким сродством (К 2.3 ± 0.2 нМ, рисунок), специфичностью (табл. 2) и не чувствительно к налоксону.
Способность немеченых аналогов октарфина — пептидов (I)—(V) ингибировать специфическое связывание [3Н]октарфина была в 100 и более раз меньшей, чем у октарфина. Это означает, что даже единичные аминокислотные замены в молекуле ок-тарфина приводят к резкому снижению сродства к
Таблица 2. Ингибирование специфического связывания [3Н]октарфина с перитонеальными макрофагами мыши налоксоном и немечеными пептидами
Лиганд ^50 Ki
нМ ± стандартное отклонение
Налоксон >10000 >10000
Р-Эндорфин 8.6 ± 0.5 2.7 ± 0.2
Иммунорфин 7.7 ± 0.6 2.4 ± 0.2
а-Эндорфин >10000 >10000
у-Эндорфин >10000 >10000
[Met5 ]энкефалин >10000 >10000
Тафтсин >10000 >10000
Октарфин 10.9 ± 0.8 3.4 ± 0.3
(I) 1113.9 ± 78.2 348.1 ± 22.6
(II) 1356.0 ± 106.7 423.8 ± 29.7
(III) 1147.2 ± 80.3 358.5 ± 18.1
(IV) 1596.4 ± 111.8 498.9 ± 34.9
(V) 1899.6 ± 133.0 593.6 ± 41.6
30000 г
с 25000 -
и 20000 h
и
-е i«
У 15000 h
о
е и н
ce m
3
m
я
m U
10000 -
5000 -
40 60 80 Время, мин
(б)
0.1
0.2
0.3 B, нМ
0.4
0.5
0.6
Зависимость общего (1), специфического (2) и неспецифического (3) связывания [3Н]октарфина с перитонеальными макрофагами мыши от времени инкубации (а); анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания [3Н]ок-тарфина с перитонеальными макрофагами мыши (б). В и Ж — молярные концентрации связанного и свободного меченого пептида соответственно.
0
рецептору. В дальнейшем в тестах на иммунокомпе-тентных клетках мыши in vitro и in vivo мы исследовали только октарфин. Тестирование аналогов было не целесообразным по причине их низкого сродства к рецептору.
Прежде всего, мы изучили влияние октарфина на адгезию, распластывание и фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мыши.
Известно, что наличие в организме воспаления приводит к усиленной направленной миграции лейкоцитов. Активированные клетки приобретают способность прилипать к сосудистому эндотелию и перемещаться в область инфекции и воспаления, при этом они изменяют свою округлую форму на звездчатую. Поэтому такие свойства фагоцитов, как адгезия и распластывание, адекватно отражают их функциональный статус. Кроме того, прикрепление и распластывание макрофагов в какой-то мере можно рассматривать как начальные стадии фагоцитоза: адгезию и обтекание частицы псевдоподиями [22]. Проведенные нами исследования показали, что у мышей, которым вводили октарфин, способность макрофагов прилипать к пластику была на 63% выше, чем у контрольных животных, которым делали инъекцию физиологического раствора. Также обнаружено, что количество распластанных клеток в опыте было на 84% больше, чем в контроле. Таким образом, октарфин при внутрибрюшинном введении мышам увеличивает способность перито-неальных макрофагов к адгезии и распластыванию.
Для изучения способности пептидов влиять на фагоцитарную активность макрофагов в качестве модельной системы был использован фагоцитоз пе-
ритонеальными макрофагами мыши бактерий вирулентного ш
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.