ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 2, с. 213-220
УДК 579.222.2:579.252.5
СВОЙСТВА НЕГОМОЛОГИЧНЫХ САЛИЦИЛАТГИДРОКСИЛАЗ
БАКТЕРИЙ РОДА Pseudomonas
© 2015 г. И. Ф. Пунтус*, Е. П. Власова*, А. П. Соколов*, Н. C. Захарченко**, Т. В. Фунтикова***
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Московской обл., 142290
e-mail: puntus@ibpm.pushchino.ru **Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
Пущино Московской обл., 142290 ***Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино Московской обл., 142290
Поступила в редакцию 22.05.2014 г.
Из штаммов Pseudomonas fluorescens 142NF и Р. putida BS3701 методами ионообменной, гидрофобной хроматографии и гель-фильтрации выделены и очищены до гомогенного состояния негомологичные салицилатгидроксилазы NahG и NahU. Выделенные ферменты различались по кинетическим и каталитическим характеристикам при гидролизе салицилата. Показано, что салицилатгидроксилаза NahU характеризовалась более высокими значениями Км и Умгк (3.1 ± 0.6 мкМ и 7.7 ± 0.4 мкмоль/мин соответственно) по сравнению с салицилатгидроксилазой NahG (1.3 ± 0.1 мкМ и 4.7 ± 0.1 мкмоль/мин). Активность обоих ферментов по отношению к замещенным салицилатам, у которых группа заместителя находилась в пара-положении, была выше, чем по отношению к салицилатам с группой заместителя в мета-положении. Активность ферментов по отношению к замещенным салицилатам, содержащим группу заместителя в мета-положении, была различной. При этом активность салицилатгидроксилазы NahU была выше по отношению к салицилатам, содержащим группу заместителя в положении 3, а салицилатгидроксилазы NahG — по отношению к салицилатам, имеющим группу заместителя в положении 5. Это может свидетельствовать о различной пространственной конфигурации активного центра выделенных негомологичных салицилатгидроксилаз.
Ключевые слова: салицилатгидроксилаза, очистка фермента, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, замещенные салицилаты.
DOI: 10.7868/S0555109915020166
Добыча нефти является одной из важнейших отраслей промышленности в России. При ежегодной добыче нефти 500 млн т в год 15 млн попадает в окружающую среду в результате ее потерь при транспортировке. На углеводороды приходится около 75% состава нефти, среди которых наиболее токсичными являются полициклические ароматические углеводороды. Основную роль в их деградации играют микроорганизмы. В результате такой деградации происходит освобождение из ароматических структур углерода с последующим вовлечением его в биологический круговорот.
В аэробных условиях разрушение ароматических углеводородов происходит путем расщепления ароматического кольца диоксигеназами. Однако эти ферменты действуют лишь в том случае, если у ароматического кольца имеются две гид-роксильные группы в орто- или пара- положении по отношению друг к другу. Поэтому введение одной или двух гидроксильных групп в ароматическое кольцо является одним из первых этапов
биодеградации ароматических соединений [1]. Моногидроксилирование, то есть введение одной гидроксильной группы в ароматическое кольцо, катализируется флавинсодержащими моноокси-геназами, которые также называются гидрокси-лазами. На следующем этапе протекают реакции, приводящие к разрыву ароматического кольца. При этом образуются алифатические соединения, которые катаболизируются с формированием ин-термедиатов цикла трикарбоновых кислот [2].
Салицилатгидроксилаза или 1-монооксигена-за (салицилат, НАДН: кислород оксидоредуктаза; КФ 1.14.13.1) относится к классу оксидоредуктаз, содержит ФАД в качестве кофактора, и катализирует декарбоксилирование и одновременное гид-роксилирование салицилата в положении 1 в присутствии НАДН, приводящее к образованию ка-техола (рис. 1).
Биохимические исследования салицилатгидроксилаз [2—8] в последнее десятилетие сопровождались многочисленными генетическими исследованиями [9, 10], которые показали большое
последовательность плазмиды биодеградации нафталина pND6-1 размером 102 т. п. н.[12]. Было показано присутствие в плазмиде двух изофунк-циональных генов салицилатгидроксилаз nahG и nahU. Сравнение нуклеотидных последовательностей этих двух генов показало, что они идентичны на 66.51%.
Цель работы — сравнение кинетических и каталитических свойств негомологичных салици-латгидроксилаз и которые экспрес-
сируются штаммами Р./¡иогезеет 142NF и Р. риН-йа Б83701.
МЕТОДИКА
Объектами исследования служили микроорганизм^! — деструкторы нафталина из коллекции лаборатории биологии плазмид Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН: штамм Р. /¡иогезеет 142NF, несущий плаз-миду pNF142, и Р. риПйа Б83701, несущий плазмиды рББ1141 и рБ81142.
Культуры выращивали в ферментере АНКУМ-2М (объемом 10 л с коэффициентом заполнения 0.6—0.7) на полноценной среде, следующего состава (г/л): кислотный гидролизат казеина — 10,
г NCIB9816 NahG
- G7 NahG
- ND6 NahU
- S-1 NahG
AJ1 NahG
AN10 NahW P. fluorescens NahG
г AN10 NahG -KF715 NahG NCIB9816-4 NahG ND6 NahG
Рис. 2. Дендрограмма гомологии 11 бактериальных салицилатгидроксилаз.
Приведены последовательности следующих салицилатгидроксилаз: NahW P. stutzeri AN10 (AF039534), NahG Sphin-gomonas sp. AJ (AB000564), NahG P. stutzeri AN10 (AF039534), NahG P. putida G7 (M60055), NahG P. putida KF715 (S80995), NahG P. putida NCIB9816 (X83926), NahG P. putida NCIB9816-4 (AF491307), NahG Pseudomonas sp. ND6 (AY208917), NahG P.putida S-1 (D67098), NahU Pseudomonas sp. ND6 (AY208917) [3]; отрезок соответствует 10% различий в нуклеотидных последовательностях.
OH салицилат- ___.___ OH
гидроксилаза ^ ^ ^v^n
+ СО2
COO НАДН НАД+ ^ OH
салицилат + O2 + H+ + H2O катехол
Рис. 1. Реакция, катализируемая салицилатгидрокси-лазой.
разнообразие этих ферментов (рис. 2). Так, наиболее распространенным геном в штаммах флуоресцирующих псевдомонад является ген салици-латгидроксилазы, гомологичный гену nahG плазмиды pDTG1 штамма Pseudomonas putida 9816-4 [10]. Для многих салицилатгидроксилаз показана широкая субстратная специфичность [2—3].
Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ампликонов генов негомологичных салицилатгидроксилаз NahG и NahU, экс-прессируемых штаммами P. fluorescens 142NF и P. putida BS3701, показал, что ген nahG P. fluorescens 142NF гомологичен гену nahG плазмиды pDTG1 штамма P. putida 9816-4, а ген nahU P. putida BS3701 — гену nahU штамма Pseudomonas sp. ND6 [9, 11]. В 2004 г. была определена нуклеотидная
дрожжевой автолизат — 70, глюкоза — 20, (NH4)2SO4 - 6, K2HPO4 - 12, MgSO4 - 0.3, MnSO4 -0.05, пеногаситель - 0.8 мл/л, салицилат - 0.2 в качестве индуктора ферментов биодеградации нафталина. Биомассу отделяли центрифугированием на центрифуге K-26D ("Janetzki", Германия) при 5600 g, в течение 20 мин при 0°С, дважды промывали 50 мМ калий-фосфатным буфером, pH 7.5, и хранили при -20°С в течение 1 мес.
Салицилат натрия, замещенные салицилаты, ФАД, НАДН, фенилметилсульфонилфторид, ди-тиотреитол, БСА ("Sigma", США) и стрептомицин ("Синтез", Россия).
Активность салицилатгидроксилазы оценивали по уменьшению оптического поглощения реакционной смеси, содержащей 100 мкМ НАДН, 10 мкМ ФАД и 100 мкМ салицилата в 1 мл 0.05 М фосфатного буфера, рН 7.5, на спектрофотометре UV-160A "Shimadzu" (Япония) при 340 нм (s = = 6.220 1/мМ • см) [13]. Реакцию запускали внесением бесклеточного экстракта (или фермента). Удельную активность фермента (Е) выражали в микромолях потребленного НАДН в 1 мин на мг белка.
Бактериальные клетки (35 г) после размораживания при 7°С суспендировали в 20 мл 20 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7.5. Клетки, содержащиеся в 5 мл суспензии (5 х 1010 кл./мл), разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе MSE-150 ("Watt", Англия) при 22 кГц 3 раза по 30 с. Гомоге-нат центрифугировали при 12000 g 20 мин при 4° С для осаждения клеточных стенок и мембранных структур. К супернатанту добавляли сульфат стрептомицина (5-10 мг/мл), инкубировали в течение 20 мин, и повторно центрифугировали при тех же условиях в течение 40 мин.
Полученный бесклеточный экстракт наносили на колонку (14 х 1.6 см) с DEAE-Toyopearl 650-M, уравновешенную 20 мМ фосфатом калия, рН 7.5. Сорбент промывали стартовым буфером. Элю-цию проводили градиентом концентрации фосфатного буфера, рН 7.5, от 20 мМ до 400 мМ со скоростью 80 мл/ч. Фракции, обладающие высокой ферментативной активностью, объединяли и к ним добавляли KCl до конечной концентрации 1.0 М.
Объединенные фракции подвергали гидрофобной хроматографии на колонке (11 х 0.9 см) с фе-нил-сефарозой CL-6B, уравновешенной 200 мМ фосфатным буфером, рН 7.5, содержащим 1.0 М KCl. Сорбент промывали стартовым буфером. Элюцию проводили градиентом, начиная с 200 мМ фосфатного буфера, рН 7.5, содержащего 1.0 М KCl, до 10 мМ трис-НС1-буфера, рН 9.0, содержащего 10% этиленгликоля, со скоростью 25 мл/ч. Фракции с максимальной активностью фермента были объединены.
В объединенную фракцию (4 мл), полученную после гидрофобной хроматографии, добавляли для повышения плотности 700 мг сахарозы и подвергали гель-фильтрации на колонке (80 х 1.6 см) с сефакрилом S-200, уравновешенным 50 мМ калий-фосфатным буфером, рН 7.5. Элюцию проводили стартовым буфером со скоростью 40 мл/ч. Фракции, в которых была найдена активность фермента, не объединяли. В каждой из них проверяли гомогенность белка. Все стадии очистки салицилатгидроксилазы проводили при 6°С.
Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд [14], используя БСА в качестве стандарта.
Гомогенность белка и молекулярную массу субъединиц определяли методом электрофореза в 12%-ном ПААГ в присутствии ДДС-Na. В качестве маркеров использовали набор стандартов ("Fermentas", Литва), включающий ß-галактози-дазу (116.0 кДа), бычий сывороточный альбумин (66.2 кДа), овальбумин (45.0 кДа), лактатдегидро-геназу (35 кДа), эндонуклеазу рестрикции Bsp98I (25 кДа), ß-лактоглобулин (18.4 кДа) и лизоцим (14.4 кДа). Электрофорез проводили при максимальном напряжении 150 В в течение 3 ч. Белки окрашивали кумасси G 250 в растворе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.