ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 2, с. 172-177
УДК 633.511.577.152
СВОЙСТВА НЕОРГАНИЧЕСКОЙ ПИРОФОСФАТАЗЫ ХЛОПЧАТНИКА
© 2007 г. Б. О. Бекназаров, М. Н. Валиханов
Национальный университет Узбекистана им. М. Улугбека, Узбекистан, 700174 г. Ташкент
e-mail: Begali 2004 @ mail.ru Поступила в редакцию 11.11.2005 г.
Исследовались активность неорганической пирофосфатазы, а также содержание пирофосфата в семенах хлопчатника в процессе их формирования и прорастания. Показано, что содержание пирофосфата в прорастающих семенах достигало максимального значения на 2 сут их формирования, а активность неорганической пирофосфатазы - через 1 сут от начала развития завязи. Низкая пиро-фосфатазная активность покоящихся семян возрастала в ходе их проращивания в открытом грунте и достигала максимума на 6-7 сут. Изучены некоторые свойства частично очищенной пирофосфатазы из трехдневных проростков семян хлопчатника, выращенных в лабораторных условиях.
Пирофосфат - простейшее соединение с мак-роэргической фосфоангидридной связью, которое играет важную роль в регуляции биохимических процессов растительных клеток [1-5]. Неорганическая пирофосфатаза (КФ 3.6.1.1.) катализирует реакцию гидролиза и синтеза пирофосфата. В последнее время большое внимание уделяется изучению пирофосфатаз микроорганизмов [6], а также Н+-пирофосфатаз вакуолярной мембраны растений [7]. Имеются сведения, что наличие пирофосфата может влиять на устойчивость растений к засолению и на поглощение ионов металлов, таких, как Са2+, Ъа2+ и Са2+ [8].
Хлопчатник является одним из важных сельскохозяйственных растений, для которого метаболизм пирофосфата и физико-химические свойства пирофосфатазы остаются малоизучены.
В предыдущих наших исследованиях установлено, что при засолении почвы увеличивается содержание пирофосфата в проростках хлопчатника [9]. При фосфорном голодании из корней хлопчатника в среду выделяются внеклеточные фосфогид-ролазы, которые гидролизуют полифосфаты с различной степенью полимеризации [10].
Цель работы - изучение содержания пирофосфата, некоторых физико-химических свойств пирофосфатазы и ее активности при формировании и прорастании семян хлопчатника.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служили завязи семян, прорастающие семена и проростки хлопчатника сорта 108-Ф (Ооззуртш hirsutum Ь).
Семена обрабатывали концентрированной серной кислотой в течение 20-30 с и промывали водопроводной водой до нейтрального рН. Полученные таким образом оголенные семена остав-
ляли в термостате для проращивания при температуре 25-27°С. Через 1 сут наклюнувшиеся семена раскладывали между листами увлажненной фильтровальной бумаги и выдерживали еще 2 сут при той же температуре. После этого проростки переносили в питательную среду Белоусова [11] и через определенное время экспозиции их корни промывали по методике Вахмистрова [12].
Проводили также вегетационные опыты с хлопчатником. Хлопчатник выращивали в сосудах Вагнера, вмещающих 20 кг воздушно-сухой почвы. Фосфорные удобрения [Са(Н2РО4)2; Р2О5 -19.3-20.0%] применяли в виде порошка при набивке сосудов в дозах 6.0 г/сосуд в расчете на Р2О5. Общее количество азота (КЫ4К03; N = = 34.2%) составляло 7 г/сосуд, а калия (КС1; К2О = = 60%) 5.0 г/сосуд в расчете на К2О. Азот вносили дробно в 5 сроков. Последнюю подкормку завершали в начале цветения. Калийные удобрения вносили в 2 срока - перед посевом и в начале цветения хлопчатника. Влажность в сосудах поддерживали на уровне 70% от полной капиллярной влагоемкости.
Исследования и фенологические наблюдения проводили, как описано ранее [13]. В фазе массового цветения хлопчатника (июль—август), цветки этикетировали в день их расцветания. Для исследования брались развивающиеся завязи после оплодотворения цветков хлопчатника. Для определения содержания пирофосфата и активности пирофосфатазы использовались 1-10-дневные проростки семян хлопчатника. Очищенные препараты пирофосфатазы выделяли из трехдневных проростков хлопчатника.
Определение содержания пирофосфата в растительном материале. Пирофосфат определяли по методу Путнинса и Ямада [14]. Растительный материал массой 3-5 г из прорастающих или же формирующихся семян хлопчатника экстрагиро-
вали с растиранием в ступке при непрерывном перемешивании первый раз с 10%-ной НСЮ4 и два раза с 2.5%-ной НСЮ4 по 30 мин при температуре 0-2°С. Полученные экстракты центрифугировали в течение 20 мин при 18000 g и 4°С. Остатки биомассы дважды промывали небольшим количеством воды. Промывные воды объединяли с экстрактами. Экстракт нейтрализовали КОН, в растворе определяли содержание ортофосфата и пирофосфата. Для определения содержания пи-рофосфата к 2 мл экстракта, содержащего от 0 до 5х10-9 М пирофосфата в пробе, добавляли 0.3 мл молибденового реактива (2.5%-ный раствор мо-либдата аммония в 5 н. H2SO4), 0.3 мл 2.5%-ного дитиотреитола и 0.12 мл 15.5%-ного раствора эйконогена. Смесь встряхивали и оставляли для развития окраски. Параллельно строили калибровочную кривую по пирофосфату в диапазоне концентрации 0-25 нмоль. Через 40 мин измеряли оптическую плотность при 580 нм на СФ-26 (Россия). Количество пирофосфата вычисляли по разнице между суммарным поглощения, определенного методом Путнинса [14], и поглощением, приходящимся на долю ортофосфата, определенного методом Беренблюма-Чейна [15] и рассчитывали в мкмоль/г сухой биомассы.
Определение пирофосфатазной активности формирующихся семян хлопчатника. Пирофос-фатазную активность определяли в свежеприготовленных гомогенатах, так как предварительные исследования показали чрезвычайную лабильность ферментных препаратов при хранении. Для приготовления гомогената брали 4-5 г навески ткани, гомогенизировали при 0-2°С в 10-15 мл 0.05 М трис-ИО-буфера, рН 7.2, с добавлением 0.01 М меркаптоэтанола и центрифугировали 30 мин при 10000 g. Супернатант использовали для определения пирофосфатазной активности.
Пирофосфатазную активность определяли по количеству образовавшегося в инкубационной среде ортофосфата, содержание которого определяли методом Беренблюма и Чейна в модификации Вейль-Малербе и Грина [15]. Инкубационная смесь содержала: 0.2 мл 0.05 М трис-НС1-буфера рН 7.2, 0.1 мл 0.005 М хлористого магния, 0.1 мл 0.003 М пирофосфата натрия ("Sigma", США), 0.1 мл ферментного препарата. Смесь инкубировали 20 мин при 37°С, реакцию останавливали 0.5 мл 0.5 М НСЮ4. В контрольных пробирках инкубировали реакционную смесь, а белковый раствор добавляли после остановки реакции. За единицу (Е) активности фермента принимали такое его количество, которое катализирует гидролиз 1 мкмоль пирофосфата за 1 мин, удельную активность выражали в Е/мг белка ферментного препарата. Белок определяли методом Лоури.
Выделение пирофосфатазы из проростков хлопчатника. Фермент экстрагировали растира-
нием замороженных проростков со стеклянным порошком в небольшом объеме трис-НСЬбуфе-ра, рН 7.2, полученный гомогенат центрифугировали при 10000 g 30 мин при температуре 2-4°С. Осадок отбрасывали, к надосадочной жидкости добавляли два объема охлажденного ацетона и оставляли на 2 ч для осаждения белков. Образовавшийся осадок собирали центрифугированием на холоду при 6000 g, растворяли в небольшом объеме исходного буфера и центрифугировали при 10000 g. Супернатант диализовали против дистиллированной воды 16-18 ч при температуре 2-4°С, образовавшийся осадок удаляли центрифугированием.
Гель-фильтрацию проводили на колонке 1.9 х х 70 см с сефадексом G-100 ("Pharmacia", Швеция), уравновешенной трис-НС1-буфером, рН 7.2. Фракции с пирофосфатазной активностью объединяли и подвергали ультрафильтрации с помощью системы "Amicon" (США), мембрана РМ-10 и наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой ("Serva", Германия), уравновешенную трис-HCI-буфером, рН 7.2. Пирофосфатазу элюировали со скоростью 0.1 мл/мин в градиенте концентрации NaCI (0-0.3 М ) в 0.05 М трис-НС1-буфере, рН 7.2. Рехроматографию проводили на ДЭАЭ-целлю-лозе ДЕ-52 ("Watman", Англия) со скоростью 0.1 мл/мин в градиенте концентрации NaCl (0-0.25 М) в 0.05 М трис-НС1-буфере, рН 7.2. Белок регистрировали на приборе Uvicord-III ("LKB", Швеция).
При исследовании влияния ионов металлов на пирофосфатазную активность использовали хлориды ("Реахим", Россия). На графиках приведены среднеарифметические данные из трех и более независимых опытов. Для кинетического анализа применяли графические методы Диксона и Уэбба [16] и Корниш-Боудена [17].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Изменение активности пирофосфатазы и содержание пирофосфата при созревании семян хлопчатника. Результаты исследований содержания пирофосфата и активности пирофосфатазы в начальные периоды формирования семян хлопчатника представлены на рис. 1а. Активность неорганической пирофосфатазы достигала максимума через 1 сут от начала развития завязи (кривая 1), через 2 сут начинала уменьшаться и на 3 сут составляла всего 34% от максимального значения. В последующие дни формирования семян активность фермента постепенно снижалась, достигнув на 6 сут 7% от максимального значения и оставаясь до конца месяца почти на таком же уровне.
Наибольшее количество пирофосфата обнаруживалось в семенах на 2 сут их формирования -
Е/мг
мкмоль/г
20
10
4 6
сут
10
Рис. 1. Содержание пирофосфата (2, мкмоль/г сухой биомассы) и пирофосфатазная активность (1, Е/мг) белка в формирующихся (а) и прорастающих (б) се-
менах хлопчатника.
Е/мг 500
400
300
200
100
18.5 мкмоль/г (рис. 1а, кривая 2), затем снижалось до 16.0 мкмоль/г на 6 сут развития семян. Таким образом, наибольшие изменения активности пирофосфатазы и содержания пирофосфата происходили в начальный период формирования семян.
Изменение активности пирофосфатазы и содержания пирофосфата при прорастании семян хлопчатника. Результаты исследования содержания пирофосфата и активности пирофосфатазы в прорастающих семенах хлопчатника представлены на рис. 16. В зрелых семенах хлопчатника пиро-фосфат обнаруживается в небольшом количестве -0.03 мкмоль/г. В процессе прорастания семян содержание пирофосфата значительно увеличивалось и достигало максимума в трехдневных проростках -12.8 мкм
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.