ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 1, с. 86-92
УДК 582.282.123.4:577.152.34
СВОЙСТВА ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ПРОТЕИНАЗЫ - АКТИВАТОРА ПРОТЕИНА С ПЛАЗМЫ КРОВИ, ОБРАЗУЕМОЙ МИКРОМИЦЕТОМ Aspergillus ochraceus © 2015 г. А. А. Осмоловский*, В. Г. Крейер*, Н. А. Баранова*, А. В. Кураков*, Н. С. Егоров**
*Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119234 **Международный биотехнологический центр Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
Москва, 119234 e-mail: aosmol@mail.ru Поступила в редакцию 18.07.2014 г.
Изучены свойства внеклеточной протеиназы — активатора протеина С плазмы крови, выделенной из культуральной жидкости микромицета Aspergillus ochraceus ВКМ F-4104D. Фермент обладал узкой субстратной специфичностью, не гидролизуя большинство хромогенных субстратов протеиназ. На основании ингибиторного анализа показано, что протеиназа — активатор протеина C A. ochraceus ВКМ F-4104D, так же, как и протеиназа — активатор протеина С из яда змеи Agkistrodon contortrix contortrix — является сериновой протеиназой. Выделенный фермент представлял собой негликози-лированный белок с молекулярной массой ~33 кДа, pI 6.0 и оптимумом активности при рН 8.0—9.0 и температуре 37°C. Сравнение свойств протеиназы, образуемой A. ochraceus, и фермента из яда змеи Agk. contortrix contortrix показало, что они близки по свойствам, однако протеиназа из микромицета не гликозилирована и способна гидролизовать хромогенный субстрат плазмина H-D-Val-Leu-Lys-pNA.
DOI: 10.7868/S0555109915010122
Микромицет Aspergillus ochraceus известен как продуцент протеолитических ферментов, обладающих фибринолитическим и коагулазным действием [1]. В последнее время было показано, что внеклеточная протеиназа A. ochraceus проявляет активаторные свойства по отношению к одному из важнейших проферментов плазмы крови — протеину С [2, 3].
Активная форма протеина С (активированный протеин С) выполняет в кровотоке антикоагу-лянтные, противовоспалительные и цитопротек-торные функции: участвует в регуляции тромбо-образования, подавлении воспаления и апоптоза эндотелиальных клеток, снижает гибель нейронов гиппокампа, вызванную действием глутамата [4—6]. Показано, что недостаточность протеина С в кровотоке может привести к тромботическим осложнениям [3]. Ввиду этого, необходимость определять содержание этого белка в плазме крови человека требует разработки соответствующих диагностических методов и препаратов. В настоящее время в клинических лабораториях для проведения такой диагностики используют метод активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), заключающийся в удлинении времени свертывания крови под воздействием активатора протеина С, и колориметрический метод, основанный на расщеплении хромогенного пептидного субстрата активированным протеином С, образующимся под действием экзогенного
активатора [7]. В диагностические наборы для колориметрического определения концентрации протеина С входят протеиназы — активаторы протеина С, получаемые из яда змей, в частности, южно-американского щитомордника А^кШт^н соп-1огГХ соМоНпх [7, 8].
Протеиназы — активаторы протеина С, образуемые микромицетом А. осктасеиш, могут оказаться более доступными и дешевыми по сравнению со змеиными, что делает продуцент перспективным альтернативным источником для получения активаторов протеина С при использовании их в составе соответствующих диагностикумов.
Цель работы — выделение и изучение свойств протеиназы — активатора протеина С плазмы крови из культуральной жидкости микромицета А. оскта-сеиш ВКМ Р-4104Э, сравнение с активатором протеина С из змеиного яда, используемого в медицине для диагностических целей.
МЕТОДИКА
Объект исследования и условия культивирования. В работе использовали штамм микромицета А. осктасеиш ВКМ Р-4104Э, отобранный в результате предыдущих исследований в качестве наиболее активного продуцента внеклеточных протеиназ — активаторов протеина С [2]. Культуру гриба выращивали в пробирках на скошенном сусло-агаре в течение 7 сут при 25°С. Для получения по-
севного материала делали смыв спор с поверхности культуры. Споровую суспензию вносили в ка-чалочные колбы емкостью 750 мл со 100 мл питательной среды, содержащей сусло, глюкозу и пептон [9] и выращивали в течение 2 сут. Затем часть биомассы переносили в ферментационную среду, следующего состава (%): глюкоза — 3.5, крахмал — 0.1, гидролизат рыбной муки — 0.5, пептон - 0.5, NaCl - 0.2, KH2PO4 - 0.05, MgSO4 -0.05. Культивирование микромицета проводили на качалке при 200 об/мин и 28°C [3].
Выделение протеиназы - активатора протеина С.
Для выделения протеиназы - активатора протеина С к 1.0 л фильтрата культуральной жидкости для осаждения белков добавляли сульфат аммония до достижения степени насыщения 80%. Выпавший осадок отделяли центифугированием в течении 20 мин при 15000 g и 4°C, после чего растворяли в минимальном объеме 0.01 М трис-HCl-буфера, рН 8.2, с 0.002 М ацетата кальция и диа-лизовали в диализных мешках против этого же буфера при 4°C в течение 12 ч на магнитной мешалке. Диализованный раствор белков центрифугировали при тех же условиях для удаления нерастворимой части, замораживали в жидком азоте и лиофильно высушивали. Полученные препараты хранили при -20°C.
Фракционирование белков полученного препарата осуществляли методом изоэлектрофоку-сирования при 4°C в градиенте рН амфолинов (3.5-10) и градиенте плотности сахарозы (0-40%) в колонке объемом 110 мл ("LKB", Швеция) при напряжении 700 В в течение 36 ч [3]. Во фракциях определяли рН, поглощение при 280 нм и протео-литическую активность. Чистоту фермента определяли с помощью электрофореза в ПААГ с №-ДЦС.
Электрофорез в ПААГ с №-ДДС проводили по методу Лэммли в 15%-ном ПААГ при силе тока в 100 мА [10]. Для определения молекулярной массы фермента использовали набор метчиков (Unstained Protein Molecular Weight Marker, "Ther-moscientific", США). Окрашивание геля осуществляли по методу Канга с соавт. [11] коллоидным раствором кумасси бриллиантовым голубым G-250, содержащим Al2(SO4)3. Для отмывки геля от красителя использовали дистиллированную воду.
Определение белка. Концентрацию белка определяли спектрофотометрическим методом при 280 нм в кювете с длиной пути 1 см [12].
Определение протеолитической активности фермента. Протеолитическую активность определяли по расщеплению хромогенного пептидного субстрата тромбина - тозил^-глицил^-пролил-L-аргинил-п-нитроанилида (Tos-Gly-Pro-Arg-NA), как описано нами ранее в работе [2]. Измерение оптической плотности проводили при 405 нм на спектрофотометре Hitachi 200-20 (Япония). Ак-тиваторную к протеину С активность определя-
ли по расщеплению хромогенного пептидного субстрата пироглутамил-Ь-пролил-Ь-аргинил-п-нитроанилида (pGlu-Pro-Arg-pNA) после предварительной инкубации пробы с плазмой человека методом, модифицированным В.Г. Крейер, описанным в работе [2].
За единицу активности (Е) принимали количество мкмоль образовавшегося п-нитроанилина в 1 мл пробы за 1 мин.
Выявление углеводного компонента протеиназы.
Наличие углеводного компонента в составе выделенной протеиназы определяли с помощью пер-йодной кислоты и реактива Шиффа (фуксинсер-нистой кислоты) методом дот-блоттинга на нитро-целлюлозных мембранах [13]. Для приготовления реактива Шиффа 0.05 г основного фуксина растворяли в 50 мл горячей дистиллированной воды, добавляли 0.5 г сульфита натрия и 0.5 мл концентрированной соляной кислоты. Через 30 мин после осветления раствора к нему добавляли 0.5 г порошкового активированного угля, перемешивали и фильтровали на стеклянном фильтре [14]. Реакционную способность полученной фуксин-сернистой кислоты проверяли по формальдегиду. В качестве положительного контроля в реакции использовали раствор внеклеточной инвертазы дрожжей, в качестве отрицательного — БСА, в концентрациях 0.5 мг/мл.
Определение субстратной специфичности. Субстратную специфичность протеиназы определяли по гидролизу хромогенных пепдидных субстратов, имеющих в качестве хромофора я-нитроанилид-ную группу (-pNA). Использовали следующие субстраты, расщепляемые протеиназами системы гемостаза: плазмина — D-Val-Leu-Lys-pNA (S-2251), Xa фактора - Bz-Ile-Glu(y-OR)-Gly-Arg-pNA (S-2222) и Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA (S-2765), урокиназы — pGlu-Gly-Arg-pNA (S-2444) и тканевого активатора плазминогена — H-D-Ile-Pro-Arg-pNA (S-2288); хромогенные субстраты трипсина Bz-Arg-pNA, химотрипсина Ac-Phe-pNA и субтилизина Z-Ala-Ala-Leu-pNA, а также субстраты с разным сочетанием аминокислот в хромопеп-тиде: Ac-Leu-Gly-Arg-pNA, Z-Gly-Gly-Leu-pNa, pGlu-Ala-Ala- Phe- Leu-pNA, Suc -Ala-Ala-Ala-pNA и Ac-Leu-Tyr-pNA. Реакции с данными субстратами проводили по методике определения активности с Tos-Gly-Pro-Arg-NA [2].
Ингибиторный анализ. В работе были использованы следующие ингибиторы: металлопротеиназ — ЭДТА (1.1 мг/мл) и о-фенантролин (0.5 мг/мл); цистеиновых протеиназ — я-ХМБ (0.5 мг/мл); сериновых протеиназ — PMSF (0.3 мг/мл); химот-рипсиноподобных протеиназ — TPCK (0.4 мг/мл); трипсиноподобных протеиназ — TLCK (0.4 мг/мл) и соевый ингибитор трипсина (1.1 мг/мл). Действие ингибиторов исследовали в молярном соотношении фермент-ингибитор 1 : 10 и 1 : 100 [15].
pH
10
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
№ фракции
Рис. 1. Изоэлектрофокусирование препарата внеклеточных белков культуральной жидкости A. ochraceus ВКМ F-4104D. 1 — активаторная к протеину С активность, 2 — рН, 3 — белок.
A280 1.25
1.00
0.75
0.50
0.25
Начальную и остаточную протеолитическую активности фермента определяли при 37°C, как описано выше после предынкубации фермента с ингибитором в течение 60—120 мин при 25 °C и выражали в процентах от контроля (без ингибитора).
Определение физико-химических свойств протеиназы. Кинетические параметры — максимальную скорость реакции (Vmax) и константу Михаэлиса (SM) определяли по гидролизу Tos-Pro-Arg-pNA, взятого в концентрациях 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 мг/мл соответственно. Кинетику реакции снимали в автоматическом режиме при использовании компьютерного обеспечения на спектро
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.