ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 1, с. 5-13
= БИОХИМИЯ =
УДК 591.463:57.089.6:577.125.33:61636-0053
СВЯЗЬ ЭКСПРЕССИИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ-АЛЬФА С АКТИВАЦИЕЙ СФИНГОМИЕЛИНАЗЫ И ПЕРОКСИДНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ ПОСЛЕ УСТРАНЕНИЯ ФАКТОРА, ПРЕПЯТСТВУЮЩЕГО ОТТОКУ ЖЕЛЧИ ИЗ ПЕЧЕНИ
© 2007 г. Л. Б. Дудник*, А. Н. Цшпко*, М. А. Шупик*, Г. Г. Ахаладзе**, Э. И. Гальперин**, Л. В. Платонова**, Э. А. Пантаз*, В. В. Яснецов***, Л. Д. Смирнов*, А. В. Алесенко*
*Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119991 Москва, ул. Косыгина, 4 **Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, 119435 Москва, ул. Большая Пироговская, 2/6 ***Государственный научный центр РФ - Институт биологических проблем РАН,
123007 Москва, Хорошевское ш., 76а E-mail: lbd@sky.chph.ras.ru Поступила в редакцию 26.12.2005 г.
Целью настоящей работы являлось исследование экспрессии фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-а), активации сфингомиелинового цикла и процессов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) после устранения фактора, препятствующего оттоку желчи из печени, подвергнутой холестазу различной продолжительности. Установлено, что при 9-суточной продолжительности застоя желчи в печени подопытных животных восстановление желчетока приводило к нормализации активности сфинго-миелиназы (СФМазы), содержания ФНО-а и уровня продуктов ПОЛ. При 12-суточном холестазе удаление фактора, препятствующего оттоку желчи, не приводило к нормализации исследуемых показателей: активность СФМазы, содержание ФНО-а и продуктов ПОЛ сохранялись на уровне, значительно превышающем контрольные показатели. Выявлена статистически значимая положительная корреляция между экспрессией ФНО-а, активностью сфингомиелиназы и интенсивностью ПОЛ. Полученные данные показывают, что апоптотическая гибель гепатоцитов при восстановлении желчетока на поздних сроках холестаза может быть обусловлена активацией сфингомиелинового цикла, интенсификацией процессов ПОЛ и усиленной экспрессией ФНО-а. Синергическое взаимодействие может резко усиливать проапоптотический потенциал каждого из этих факторов, поскольку ФНО-а активирует СФМазу и процессы ПОЛ, активность СФМазы зависит от интенсивности реакций ПОЛ, а вторичный посредник сигнала апоптоза - церамид, генерируемый СФМазой, способен индуцировать окислительный стресс.
Известно, что апоптоз (программируемая клеточная смерть) клеток печени может быть индуцирован активацией сигнальных систем сфингомиелинового цикла и генерации активных форм кислорода (Hannun, 1996; Chandra et al, 2000). Важным внеклеточным стимулом, активирующим сфинго-миелиназу (СФМазу), ключевой фермент сфингомиелинового цикла, а также окислительные системы клетки, является провоспалительный цитокин фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-а) (Liu et al., 1998; Li et al., 2001). Активность СФМазы, в свою очередь, зависит от интенсивности окислительных процессов в клетке, а продукты гидролиза сфингомиелина ферментами сфингомиелинового цикла (вторичные посредники сигнала апоптоза -церамид и сфингозин) способны индуцировать окислительный стресс и экспрессию ФНО-а (Liu, Hannun, 1997; Komatsu et al, 2001; Andrieu-Abadie et al., 2001; Alessenko et al, 2005). Такое взаимодействие может приводить к усилению действия
тех повреждающих факторов, основным звеном цитотоксического действия которых является окислительный стресс.
Частой причиной гибели гепатоцитов по механизму апоптоза является застой желчи в ткани печени, называемый холестазом. Считают, что повреждение паренхимы печени при холестазе обусловлено токсическим влиянием компонентов желчи, а также механическим давлением расширенных желчных канальцев. Тем не менее, при длительном холестазе удаление фактора, препятствующего желчетоку, зачастую не приводит к нормализации функций печени (Patel, Gores, 1995; Rodrigues, Steer, 2000). Хирургические вмешательства у больных с механической желтухой сопровождаются большим числом осложнений, тяжелейшим из которых является развитие печеночной недостаточности, обусловленной повреждением и гибелью гепатоцитов и способной приводить к летальному исходу (Гальперин и др., 1978). Причины
повреждения печени при хирургическом лечении холестаза изучены недостаточно. В связи с этим в настоящее время у больных механической желтухой иногда проводят двухэтапное хирургическое лечение - на первом этапе выполняют временную декомпрессию билиарных путей с помощью различных методов желчеотведения, а на втором стараются устранить причину, вызвавшую прекращение желчетока. Определение сроков и видов проводимых оперативных вмешательств, а также выработка методов прогнозирования осложнений послеоперационного периода и их профилактики являются чрезвычайно актуальными.
Ранее нами было обнаружено, что при холеста-тическом повреждении печени, вызванном перевязкой общего желчного протока у крыс, происходят однонаправленные изменения факторов, играющих ведущую роль в индукции апоптоза, - активности СФМазы, содержания ФНО-а и уровня продуктов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) - снижение этих показателей на ранних сроках эксперимента и резкое их повышение - в условиях развившейся патологии (Дудник и др., 2005).
В связи с вышеизложенным нам представляется важным исследование экспрессии ФНО-а, активации сфингомиелинового цикла и процессов ПОЛ после устранения фактора, препятствующего оттоку желчи из печени, подвергнутой холеста-зу различной продолжительности. В настоящей работе нами предпринято изучение перечисленных показателей, а также взаимосвязи между ними при восстановлении желчетока после разных сроков перевязки общего желчного протока у крыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Механическую желтуху (холестаз) с последующим восстановлением оттока желчи у крыс линии Wistar моделировали по методу, описанному в работе (Гальперин и др., 1991). У подопытных животных после наложения двойной лигатуры на внепанкреатический участок общего желчного протока производили рассечение протока; в его проксимальный конец вводили полиэтиленовый катетер с запаянным концом. Лапаратомия проводилась под наркозом (внутривенное введение бриетала в дозе 50 мг/кг). Время холестаза составляло 9 и 12 сут. Восстановление оттока желчи осуществляли методом наружного дренирования (декомпрессии) желчных путей, посредством отсечения кончика катетера, введенного в общий желчный проток. Образцы печени исследовали через 3-18 сут после восстановления желчетока. После истечения сроков механической желтухи и восстановления оттока желчи крыс декапитиро-вали, печень перфузировали, иссекали и гомогенизировали для дальнейших исследований. В качестве контроля использовали печень интактных и ложнооперированных животных (наркоз, лапа-
ротомия и манипуляции на общем желчном протоке без его перевязки и рассечения). На каждую экспериментальную точку использовали по 8-12 животных.
Количественное определение белка проводили по методу Лоури и др. (Lowry et al, 1951).
Липиды из гомогената печени экстрагировали по методу Блайя и Дайера (Bligh, Dyer, 1959), их количество определяли гравиметрически.
Интенсивность ПОЛ оценивали по содержанию диеновых коньюгатов и диенкетонов. Электронные спектры растворов липидов в смеси мета-нол-гексан регистрировали на спектрофотометре фирмы "Beckman" (США). Используя молярные коэффициенты поглощения 21000 л/(моль • см) для диеновых коньюгатов и 23 000 л/(моль • см) для диенкетонов, рассчитывали количество продуктов ПОЛ в 1 мг исследуемых липидов (Стальная, Гаришвили, 1977).
Идентификацию ФНО-а в печени проводили с помощью ECL-иммуноблоттинга с поликло-нальными антителами производства фирмы Santa Cruz (США), специфически связывающимися с ФНО-а крысы и мыши. Белки гомогената печени разделяли электрофорезом в 13%-ном полиакрила-мидном геле по методу (Laemmli, 1970). В качестве контроля использовали рекомбинантный ФНО-а мыши, полученный в лаборатории В.Г. Коробко Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Для детекции связывания антител с ФНО-а использовали детектирующий нерадиоактивный реагент ECL производства фирмы Amersham Life Science (Англия).
Сфингомиелиназную активность определяли в гомогенате печени по методу (Hostetler, Yazaki, 1979), используя 12 мкМ ^-метил-14С)сфинго-миелин с удельной активностью 0.1 Ки/ммоль, разбавленный 50 мкМ "холодным" сфингомиели-ном в tm-HCl-буфере, pH 7.2. Об активности сфингомиелиназы судили по переходу метки в виде водорастворимого продукта реакции - (14С)-хо-линфосфата в водно-метанольную фазу. Радиоактивность определяли в аликвоте верхней, водно-метанольной, фазы на счетчике Delta (Нидерланды).
Полученные результаты обрабатывали методом вариационной статистики, достоверными считали различия при p < 0.05. На рисунках и в таблицах приведены среднеарифметические значения показателей и ошибки среднеарифметического значения.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Ранее нами были обнаружены качественные различия в динамике изменения активности СФМазы, уровня ФНО-а и продуктов ПОЛ на ранних и поздних сроках развития холестатического по-
Таблица 1. Изменение активности СФМазы, содержания ФНО-а и продуктов ПОЛ в печени крыс при восстановлении желчетока после 9-суточной перевязки общего желчного протока
Время эксперимента, сут Активность СФМазы, имп./(мин х мг белка) ФНО-а, мкг/мг белка Диеновые конъюгаты, нмоль/мг липидов Диенкетоны, нмоль/мг липидов
Опыт
0 23.2 ± 1.0*' ** 0.29 ± 0.03*' ** 21.1 ± 1.8*, ** 9.5 ± 0.8*, **
3 36.2 ± 3.6** 0.54 ± 0.03 22.1 ± 2.2*, ** 11.5 ± 0.6*, **
6 34.5 ± 2.7 0.54 ± 0.03 31.7 ± 3.2* 18.2 ± 1.7*
12 36.0 ± 3.6** 0.60 ± 0.04*' ** 30.2 ± 3.0 16.2 ± 1.6
18 27.3 ± 2.3 0.48 ± 0.05 26.7 ± 2.4 14.5 ± 0.9
Интактный контроль
29.5 ± 2.9 0.49 ± 0.03 27.7 ± 0.9 14.3 ± 0.4
Ложная операция
0 33.6 ± 2.3 0.50 ± 0.03 30.1 ± 2.1 13.9 ± 1.0
3 32.6 ± 1.2 0.53 ± 0.05 28.0 ± 2.3 14.6 ± 0.9
6 30.3 ± 2.0 0.54 ± 0.04 26.4 ± 2.2 14.5 ± 1.1
12 30.0 ± 2.1 0.50 ± 0.03 27.0 ± 1.4 14.5 ± 0.7
18 29.0 ± 2.4 0.50 ± 0.03 27.2 ± 1.3 14.2 ± 0.7
* Достоверные различия с показателями контроля (ложная операция),р < 0.05. (Для табл. 1-2.) ** Достоверные различия с показ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.