ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2007, том 49, № 9, с. 1689-1702
МЕМБРАНЫ
УДК 541.64:539.2:532.72
СВЯЗЬ МЕЖДУ СТРУКТУРОЙ СОЕДИНЕНИЙ И ВЛИЯНИЕМ ПЛЮРОНИКА Ь61 НА ИХ ТРАНСПОРТ ЧЕРЕЗ ЛИПИДНЫЕ МЕМБРАНЫ1
© 2007 г. В. С. Бугрин, Н. С. Мелик-Нубаров
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.
Химический факультет 119992 Москва, Ленинские горы Поступила в редакцию 22.11.2006 г.
Принята в печать 19.02.2007 г.
Ранее было показано, что встраивание плюроников в липидные мембраны способствует увеличению их проницаемости по отношению к различным лекарствам. Исследована взаимосвязь между структурой переносимого через мембрану соединения и ускорением его мембранного транспорта, вызываемого плюроником. Степень ускорения, определяемая как соотношение наблюдаемых констант скорости транспорта в присутствии и в отсутствие плюроника к/к0, была определена для 21 слабой кислоты и основания. Построены многопараметрические корреляции полученных данных с различными структурными параметрами переносимых через мембрану веществ. Проанализировано 12 структурных параметров транспортируемых соединений и показано, что наилучшая корреляция к/к0 наблюдалась с линейной комбинацией трех параметров: мак-говановского объема соединения V, его протонодонорной способности А и проекции дипольного момента молекулы на нормаль к поверхности мембраны \х2: Щк/к^) = -0.87 - 0.44|л,2 + 0.31 V + 0.28А, Я = 0.90. Это означает, что плюроник в наибольшей степени ускоряет транспорт крупных соединений, содержащих прото-нодонорные группы, и тех веществ, которые встраиваются в липидный бислой таким образом, что вектор их дипольного момента сонаправлен с дипольным потенциалом мембраны.
ВВЕДЕНИЕ
Триблок-сополимеры этиленоксида (ЭО) и пропиленоксида (ПО), известные под торговой маркой Pluroшcs® (плюроники) или Poloxamers® (полоксамеры) [1], представляют собой семейство амфифильных сополимеров, широко востребованных в технологии добычи нефти [2], эмульсионной полимеризации [3], создании моющих средств [4] и т.д. В конце 1980-х годов было обнаружено, что плюроники обладают относительно низкой токсичностью. Это открыло широкие перспективы использования этих полимеров в качестве биосовместимых ПАВ [5]. Дальнейшие исследования поведения плюроников в биологическом окружении показали, что они способны усиливать иммунный ответ [6], влиять на
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 06-03-32403) и гранта Государственной поддержки ведущих научных школ (НШ 5899.2006.3).
E-mail: melik.nubarov@genebee.msu.ru (Мелик-Нубаров Николай Сергеевич).
метаболизм холестерина [7], ингибировать белковые насосы, обусловливающие множественную лекарственную устойчивость раковых клеток [8, 9].
Физиологические эффекты плюроников в основном определяются их взаимодействием с ли-пидными компонентами биологических мембран [9]. Поэтому в настоящей работе было исследовано взаимодействие сополимеров этого класса с модельными липидными структурами. Ранее было показано, что встраивание плюроников в липидные мембраны вызывает уменьшение микровязкости бислоя [10], увеличивает скорость транс-бислойной миграции липидов [11] и ускоряет мембранный транспорт противоопухолевого антибиотика доксорубицина [11-13]. Оказалось, что эффект полимеров на перенос лекарств через биологические мембраны зависит как от структуры самого полимера [11, 13], так и от липидного состава мембран [14]. Наибольшей эффективностью обладают гидрофобные плюроники, содержащие около 10% ЭО-звеньев [11]. Эти факты
1689
хорошо согласуются с ранее опубликованными данными о взаимосвязи между составом плюро-ников и их способностью усиливать противоопухолевую активность лекарств по отношению к клеткам, обладающим множественной лекарственной устойчивостью [8, 9]. Однако до настоящего времени совершенно не исследованным остается вопрос о том, в какой степени химическая структура переносимого через мембрану вещества определяет эффект полимера на скорость его проникновения. В настоящей работе впервые предпринята попытка исследовать количественные корреляции между структурными параметрами переносимых через мембрану веществ и степенью воздействия плюроника на этот процесс. В качестве характерного представителя полимеров такого типа мы использовали плюроник L61, который характеризуется оптимальным соотношением между токсичностью и степенью воздействия на накопление лекарств в раковых клетках [8, 9].
Для решения поставленной задачи был использован подход, основанный на построении корреляций между вызываемым плюроником ускорением транспорта низкомолекулярных соединений через липидную мембрану и структурными параметрами переносимых веществ. В качестве таких параметров мы рассмотрели объем, гидрофобность, поляризуемость, индекс мольной рефракции соединений, их способность к образованию водородных связей и предполагаемую ориентацию во внутримембранном электрическом поле. Все параметры рассчитаны исходя из структуры веществ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали плюроник L61 производства "BASF Corp." (США). По данным ГПХ, для этого сополимера Mn = 1655 и Mw = 1890 (индекс полидисперсности Mw /Mn = 1.14). Средний состав полимера, определенный методом ИК-спек-троскопии, соответствовал 10 мас. % звеньев ЭО, а его структура отвечала заявляемой фирмой-производителем (ЭО2ПО30ЭО2). В работе использовали хроматографически чистый яичный леци-
тин, ииранин производства "Sigma-AЫrich Co." (СТА).
Соединения, мембранный транспорт которых был исследован в этой работе, также были приобретены у "Sigma-Aldrich Co." ^ША):
гидроксигиппуровая кислота (ННА)
O
V о
O
^ацетил^-тирозин (Ac-Tyr) OH
O
OH
*Vri ,
H3C^NH O
OH
доксорубицина гидрохлорид (DOX)
O OH
H3C
OH
nh2
и дауномицин гидрохлорид (DNM)
O OH CH3
H3C
NH2
Некоторые оксикислоты и N-замещенные производные аминокислот были производства "Reanal" (Венгрия):
К-трет-бутил-оксикарбонил-Х-триптофан К-динитрофенил-£-аланин (DNP-Ala) (Boc-Trp)
ОН
О \\
О'
НзС п .КН
Н3С
>сг
СНз О
О-
N
О
К о- о
ОН
СНз
К-карбобензокси-у-аминомасляная кислота №- К-динитрофенил-Х-лейцин (DNP-Leu) GABA)
О
ОН
О
К-карбобензокси-^,Х-тирозин (Cbz-Tyr)
НО }
КН
НО
О
-с
О
О
К-карбобензокси-£-триптофан (Cbz-Trp)
ОН
холевая кислота (ChA)
О
На,НзС
ОН
Н
НО
Н3С
^—СН3
НО—<
О О —К \\
О
О-
О
К-динитрофенил-£-метионин (DNP-Met) О-
О
НК
СН3
I
II
О
N /
О-
-,О
К-динитрофенил-£-фенилаланин (DNP-Phe)
О \\
№-О- О
ОН
К-динитрофенил-£-триптофан (DNP-L-Trp)
ОН
О-
О
\\ О
КН
^ г
^динитрофенил^-тирозин (DNP-Tyr)
O^y
O-
"N+ II
O
OH
^динитрофенил^-валин (DNP-Val)
O
O-
J*
-N+
O lY O-CH3 OH
N-бензоил-^-аланин (Benz-b-Ala) O
O
NH^a ,
OH
^динитрофенил^-гистидин (DNP-His)
O
OI
Д
N
O
f-NHHN
N+
O
4O-
OH
^бензоил^-гистидин (Benz-His)
O^/OH
Anh
W
^бензоил^-норвалин (Benz-Norval)
x
■m I
O
NH
CH3
Антибиотик линкомицин (Linco) - производства "Верафарм" (Россия)
CH3
С ch3
|,N.
CH3
HO NH
HO
H H
—n
O
S
OH ^3
Растворители и компоненты буферных растворов квалификации ч.д.а. применяли без дополнительной очистки.
Получение рН-градиентных липосом. Кинетику мембранного транспорта флуоресцирующих соединений, DOX и DNM изучали с помощью липосом с заранее сформированным градиентом рН между внутренней средой и внешним раствором. Моноламелярные липосомы размером 70-100 нм получали по ранее описанной методике [15] и использовали в течение 10 ч после получения.
Изучение кинетики транспорта антрациклино-вых антибиотиков в рН-градиентные липосомы (рис. 1а). Растворы DOX или DNM смешивали с предварительно термостатированной суспензией рН-градиентных липосом (конечная концентрация антибиотиков 5 х 10-5 моль/л) и изменение флуоресценции во времени регистрировали при
*возб
= 480 нм и ^фл = 555 нм.
Получение липосом, заполненных флуоресцентным рН-индикатором пиранином (рис. 1в).
Раствор 20 мг яичного лецитина в 0.2 мл этанола тщательно упаривали на роторном испарителе "Heidolph" (модель "Rotavapor", 120 мин-1, 40°C). Липидную пленку суспендировали в 1 мл 5 х 10-4 моль/л раствора пиранина в 0.1 М буферном растворе HEPES (гидроксиэтил-пипиразин-этансульфокислота)/КОН, рН 8.2. Липидную суспензию подвергали трем циклам замораживания-оттаивания (-196°С/+40°С), после чего обрабатывали ультразвуком в токе азота с помощью ультразвукового генератора "Cole Parmer" (модель 4700, 200 с, 22 кГц, 30 Вт), охлаждая образец в ледяной воде. Полученные липосомы отделяли от титановой пыли центрифугированием (микроцентрифуга "Beckman", 10 мин, 9400g). Согласно данным динамического светорассеяния (спектро-
(a)
pH
1555, отн. ед. 1.0
(б)
0 50 100 150 200 [DOX] х 106, моль/л
(В)
1509
отн. ед.
Рис. 1. Схема модельных систем, использованных для изучения транспорта антрациклиновых антибиотиков (а) и нефлуоресцирующих соединений (в) в липосомы, а также зависимости флуоресценции доксору-бицина от его концентрации (б) и рН-индикатора пиранина от рН (г). На рис. (г) показана формула пира-нина.
метр фирмы "Malvern", модель Autosizer 2c), полученные липосомы имели средний гидродинамический диаметр 70-100 нм. Липосомы отделяли от свободного пиранина с помощью ГПХ на колонке (1.1 х 18 см) с полисахаридным носителем Sepharose CL-4B ("Amersham"), уравновешенной буфером 0.1 M HEPES/KOH, pH 8.2.
Кинетика проникновения слабых кислот и оснований через мембраны липосом, заполненных раствором пиранина (рис. 1в). Кинетику изучали согласно модифицированному методу, ранее предложенному Kamp и Hamilton [16]. 1 мл 10-4 моль/л раствора слабой кислоты или 2 х 10-5 моль/л раствор Linco термостатировали во флуоресцентной кювете. После установления стабильной температуры образца в раствор добавляли 0.2 мл суспензии липосом, заполненных пиранином (5 мг/мл), и регистрировали изменения флуоресценции (А,возб = = 455 нм, Афл = 509 нм) с помощью спектрофлуо-риметра "Hitachi" (модель 650-10S). Проникновение слабых кислот и оснований в липосомы по механизму распределения-диффузии приводило к изменению рН внутрен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.