ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 6, с. 711-719
ФИЗИОЛОГИЯ животных ^^^^^^^^^^^^ И ЧЕЛОВЕКА
УДК 612.821:615.214
СВЯЗЬ СТРУКТУРЫ ДЕРМОРФИНОВ С их ТЕРМОРЕГУЛЯТОРНОЙ
АКТИВНОСТЬЮ
© 2007 г. Т. Г. Емельянова*, Л. С. Гузеватых*, Л. А. Андреева**, Л. Ю. Алфеева**, Н. Ф. Мясоедов**
*Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, 119991 Москва, ул. Косыгина, 4 **Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Курчатова, 46
E-mail: emel@chph.ras.ru Поступила в редакцию 16.08.2006 г.
Изучено влияние структурных изменений в молекуле дерморфина на функциональное состояние системы терморегуляции крыс, находящихся в холодной, термонейтральной и жаркой средах. Проведены исследования температурной и вазомоторной активностей 43 пептидов (фрагментов и аналогов) по сравнению с деморфином. Изучена роль аминокислотных остатков во втором, третьем, четвертом и шестом положениях. Установлено, что разные фрагменты молекулы деморфина отвечают за разные виды терморегуляторной активности (гипотермический эффект сохраняется у N-концевого тетрапептида деморфина, а реакция вазодилятации - у N-концевого гексапептида), а направленная модификация его молекулы позволяет разделить гипотермическую, сосудорасширяющую и сосудосуживающую активности. Высказано предположение, что деморфин является ли-гандом не только ц-опиатных рецепторов.
В 1981 г. итальянские ученые выделили из кожи южноамериканских лягушек рода Philomedusa биологически активный гептапептид (Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2 - деморфин (ДМ)) (Mon-tecucchi et al., 1981a, Broccardo et al., 1981) и похожий пептид, содержащий гидроксипролин -[Hyp^-ДМ (Montecucchi et al, 19816). Позднее было выделено еще 5 гомологов ДМ (Erspamer et al., 1989, Mignogna et al, 1992). ДМ обнаружены в органах и тканях теплокровных животных, в том числе и в центральной нервной системе (Broccardo et al., 1981). Общим в первичной структуре всех природных ДМ является наличие N-концевой последовательности Tyr-DAla-Phe, в которой между двумя ароматическими кольцами Tyr и Phe присутствует остаток DAla. Присутствие DAla во втором положении обусловливает специфику биологической активности ДМ, которая практически исчезает при замене его на L-изомер (Erspamer, 1992). Несмотря на то, что все дерморфиноподоб-ные пептиды, выделенные из кожи амфибий, содержат DAla2 (Erspamer, 1992), триплетный кодон аланина в геноме, кодирующем ДМ, соответствует L-изомеру (Richter et al., 1987, 1990). Однако в экстрактах кожи лягушки не обнаружено LAla2-дерморфинов, что свидетельствует о механизме посттрансляционной эпимеризации, обеспечивающей превращение LAla в D-изомер (Mor et al., 1991; Kreil, 1994).
Предшественник ДМ - продерморфин, содержит 4 или 5 гомологичных повторений, состоящих из 35 аминокислот, каждое из которых вклю-
чает копию ДМ, отделенную типичным прогор-мональным процессинговым сигналом Lys-Arg на N-конце и Gly-Glu-Ala-Lys-Lys на карбоксильном конце (Richter et al., 1987). ДМ являются специфическими лигандами ц-опиатных рецепторов (Gi-agnoni et al., 1984). Высокое сродство и избирательность ДМ к ц-опиатным рецепторам обусловливает широкий спектр их физиологической активности. Интерес к семейству ДМ связан с их чрезвычайно высокой анальгетической активностью. Эффективность ДМ в анальгетических тестах при периферическом введении выше эффективности морфина в 10-25 раз (Castiglione et al, 1981; Rossi et al., 1983; Stevens et al., 1986; Braga et al., 1984). Как все эндогенные пептиды, ДМ оказывает влияние на разные физиологические системы: сердечно-сосудистую, дыхательную, выделительную, мышечную, терморегуляторную и др. (Broccardo, 1987; Melchiorri, Negri, 1996; Emel'yanova et al., 1996). Впервые в 1987 г. Брок-кардо (Broccardo, 1987) показала, что при внутри-мозговом введении ДМ наблюдаются изменения в системе терморегуляции. Позднее при внутри-брюшинном (в/б) введении нами было показано, что ДМ вызывает дозо- и температуро-зависи-мые изменения температуры тела, сопровождающиеся изменениями периферических сосудистых компенсаторных реакций (Emel'yanova et al., 1996).
В настоящем исследовании изучали влияние изменения структуры молекулы ДМ на функциональное состояние системы терморегуляции
(температуру тела и вазомоторные реакции) крыс, находящихся при разной температуре окружающей среды. Изменение структуры молекулы ДМ проводили путем укорочения, удлинения или модификации пептидной цепи. Целью структурно-функциональных исследований являлось определение минимального фрагмента ДМ, необходимого для проявления температурной и вазомоторной активностей, а также проведение сравнительного анализа температурной и вазомоторной активностей при замене одного или нескольких аминокислотных остатков у самого ДМ и его фрагментов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали ДМ, его фрагменты и аналоги, синтезированные в Институте молекулярной генетики РАН (Москва). Всего было синтезировано и исследовано 43 пептида. Синтез осуществляли по ранее опубликованной схеме (Broc-cardo et al., 2003).
Объектом исследования служили самцы нелинейных белых крыс массой 180-250 г. Пептиды вводили в/б в виде водного раствора в объеме 1 мл/кг веса животного. Контрольные животные получали инъекцию эквивалентного объема дистиллированной воды. Пептиды вводили в дозе 0.5 мг/кг, как наиболее активной (Emel'yanova et al., 1996). Всего было проведено 3024 эксперимента (по 8-14 животных в группе). Животные использовались однократно. Эксперименты проводили по ранее отработанной методике (Emel'yanova et al., 1996). Измерения температуры тела (АТт) и температуры кожи хвоста (АТХВ), рассчитывали по формуле: АТ = Т - Тисх, где Т -величина Тт или Тхв, зафиксированная в i-й момент времени; Тисх - исходная температура тела или кожи хвоста - среднее арифметическое из трех показателей, зафиксированных за 30, 20 и 10 мин до инъекции.
Терморегуляторные эффекты пептидов изучали в трех температурных режимах, отражающих разное функциональное состояние системы терморегуляции (Gordon, 1990): в холодной среде (Тк (температура камеры) = 4-6°С), в комфортной для крыс среде (Тк = 27-28°С) и в жаркой среде (Тк = 31-32°С).
Результаты экспериментов статистически обрабатывали, используя непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни в статистических пакетах программ Microsoft Excel 2000 и Статистика 6.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Основные результаты проведенных исследований представлены в таблице. ДМ при в/б введении в дозе 0.5 мг/кг вызывал температуро-зависи-
мые гипотермию и изменение вазомоторного тонуса. В термонейтральной среде (Тк = 27-28°С) ДМ вызывал двухфазное изменение тонуса периферических сосудов, реакция вазодилятации сменялась реакцией вазоконстрикции (Emel'yanova et al., 1996). В таблице температурный и вазомоторные эффекты ДМ во всех температурных режимах приняты за 100%. Эффекты остальных фрагментов и аналогов оценивали относительно активности ДМ. При Тк = 31-32°С ДМ в дозе 0.5 мг/кг (Emel'yanova et al., 1996) не оказывал влияния на изменение тонуса периферических сосудов.
Укорочение молекулы ДМ с С-конца. ДМ имеет короткое время жизни в крови (t1//2 = 1.3 мин). Через 5 мин после введения в крови крысы содержится только 7% от введенного пептида, 34% из которых составляет интактный ДМ и 60% - продукты распада (ди-, три- и тетра-К-концевые фрагменты) (Darlak et al., 1988).
При укорочении ДМ с С-конца наблюдалось снижение активности пептидов в холодной и комфортной средах (таблица, секция А). Гипотерми-ческий эффект фрагментов ДМ1-6 и ДМ1-5 в холодной среде составлял 61 и 58%, а в комфортной - 65 и 39% соответственно. Минимальным фрагментом, обладающим гипотермической активностью, являлся ДМ1-4 (22% в холоде и 20% в комфорте), тогда как вазомоторной и только в термонейтральной среде - ДМ1-6, у которого частично сохранялась только первая фаза - реакция вазодилятации, и полностью отсутствовала вторая фаза - реакция вазоконстрикции.
Трипептид Pro-Gly-Pro способствует стабилизации молекул пептидов (Ашмарин и др., 2002). Удлинение с С-конца этим трипептидом ДМ1-3 и ДМ1-5 не повлияло на изменение активности фрагментов ДМ.
Роль второго аминокислотного остатка в молекуле ДМ. Эксперименты показали (таблица, секция Б), что замена DAla2 на DArg2 приводила к уменьшению гипотермической активности ДМ. Гипотермический эффект [DArg^-ДМ в холоде составлял 34%, при Тк = 27-28°С - 16%, а при Тк = = 31-32°С - всего 10%. Вазомоторная активность [DArg^-ДМ наблюдалась только в холодной среде.
Замена DAla2 на Gly2 или на DOrn2 приводила к полной потере активностей ДМ.
Замещение второго аминокислотного остатка другими D-изомерами не изменяло место разрыва молекулы ферментами мозга, но могло повысить устойчивость к пептидазам. Сасаки с соавт. (Sasaki et al, 1985а) нашли, что ДМ и [DArg^-ДМ подвергаются похожими путями деградации в мозге до N-концевого тетрапетида, но связь Tyr-DArg более устойчива к разрушению аминопептидаза-ми, чем Tyr-DAla (Sato et al., 1992; Sasaki et al.,
СВЯЗЬ СТРУКТУРЫ ДЕРМОРФИНОВ Температурная и вазомоторная активности дерморфина, его фрагментов и аналогов
Дерморфин Структура Температура тела, % Температура кожи хвоста, %
4-6°С 27-28°С 31-32°С 4-6°С 27-28°С* 31-32°С
ДМ Tyr-DЛ1a-Phe-G1y-Tyr-Pro-Ser-NH2 100 100 100 100 100 / 100 -
ДМ1_6 ДМ1-5 ДМ1-4 ДМ1-3
ДМ1-3-Рш^1у-Рш ДМ1-5-Рш^1у-Рш
[01у2]-ДМ
[БЛ^2]-ДМ
[БОт2]-ДМ
[Тгр3]-ДМ [Тгр3]-ДМ1_
Кге-ДМ
Секция А (укорочение ДМ с С-конца)
Туг-БЛ1а-РИе-01у-Туг-Рго-КН2 61
Туг-БЛ1а-РЬе-01у-Туг-МН2 58
Туг-БЛ1а-РИе-01у-КН2 22
Туг-БЛ1а-РИе-КН2 Туг-БЛ1а-РИе-Рго - в1у -Рго -^ЫН2 Туг-БЛ1а-РИе-01у-Туг-Рго-01у-Рго-КН2
Секция Б (замещение БЛ1а" Туг-01у-РИе-01у-Туг-Рго-8ег-КН2 Tyr-DЛrg-Phe-G1y-Tyr-Pro-Ser-NH2 Туг-Б0т-РЬе-01у-Туг-Рго-8ег-КН2
Секция В (замещение Phe3)
44
34
65 39 20
)
I
Tyr-DA1a-Trp-G1y-Tyr-Pro-Ser-NH2 Tyr-DЛ1a-Trp-G1y-Tyr-NH2
48
60(д)
16
21 19
10
I
20
110
51/-/--/--/-
-/--/-
-/--/--/-/38 -/40
I
[Тф3]-ДМ1-4 Tyr-DЛ1a-Trp-G1y-NH2 20 - - - 34/20
Секция Г (замещение G1y4) 1
[DЛ1a4]-ДМ Tyr-DЛ1a-Phe-DЛ1a-Tyr-Pro-Ser-NH2 70 23 - 54/94
[DЛ1a4]-ДМ2-7 DЛ1a-P
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.