РАДИОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ
УДК [57+61]:539.1.047:611.018:616-006:616.6:615.84
СВЯЗАНЫ ЛИ СВОЙСТВА ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ?
© 2014 г. И. И. Пелевина1, *, А. В. Алещенко2, М. М. Антощина3, В. А. Бирюков3, О. Б. Карякин3, О. В. Кудряшова1, М. Ф. Никонова4, Н. Г. Минаева3, А. М. Серебряный2, |А. А. Ярилин|4
Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва 2Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва 3Медицинскийрадиологический научный центр Минздрава России, Обнинск 4Институт иммунологии ФМБА России, Москва
В лимфоцитах периферической крови здоровых людей и больных раком предстательной железы (РПЖ) изучали поврежденность генома (частоту клеток с микроядрами и аберрациями хромосом), концентрацию активных форм кислорода (АФК), экспрессию маркеров активации (CD69), пролиферации (Ki67) и проапоптотического антигена CD95 Т-лимфоцитов, адаптивную способность. Исследовали также влияние гормонотерапии на свойства лимфоцитов и связь изученных показателей с эффективностью лечения, которую оценивали по уровню содержания в крови простатспеци-фического антигена (ПСА). Было обнаружено, что поврежденность генома при РПЖ не отличается от контроля, наблюдаются снижение радиочувствительности (облучение лимфоцитов в условиях in vitro в дозе 1 Гр) и повышение концентрации АФК, но эти изменения статистически незначимы. Содержание клеток, экспрессирующих маркеры CD69 и CD95, при РПЖ не изменяется, снижается экспрессия маркера пролиферативной активности Ki67. Радиочувствительность лимфоцитов при РПЖ коррелирует с экспрессией маркера CD95: при более высокой радиочувствительности этих клеток можно предполагать предрасположенность их к апоптотической гибели. Введение гормонов, курс которых проводят перед лучевой терапией, приводит к увеличению радиочувствительности лимфоцитов при РПЖ, снижению содержания АФК. Адаптивная способность лимфоцитов крови при РПЖ возрастает статистически незначимо, на нее гормоны не влияют, но высокий окси-дативный статус способствует формированию адаптивного ответа. Для прогноза лечения представляется очень важным обнаруженная нами корреляционная связь между исходной (до начала лечения) частотой клеток с МЯ и эффективностью лечения: чем меньше поврежденных клеток, тем выше эффективность лечения. Полученные результаты могут иметь значение для экспериментального обоснования и понимания возможности использования лимфоцитов крови для дополнительной диагностики РПЖ и прогноза успеха его лечения.
Лимфоциты крови человека, рак предстательной железы, микроядра, аберрации хромосом, активные формы кислорода, иммунологические показатели, радиочувствительность, корреляции.
DOI: 10.7868/S0869803114030126
По данным российских и зарубежных исследований частота рака предстательной железы (РПЖ) у мужчин все время растет и выходит на третье место среди всех злокачественных новообразований [1, 2]. За последние 10 лет число больных РПЖ в России увеличилось на 25.5% [1]. В США 27000 человек ежегодно погибает от РПЖ, в Европе каждый год выявляется 2.6 млн мужчин, больных РПЖ [3].
* Адресат для корреспонденции: 119991 Москва, ул. Косыгина, 4, ФГБУН ИХФ РАН; тел.: (495) 939-74-47; факс: (495) 938-21-56; e-mail: pele@chph.ras.ru.
Риск развития РПЖ зависит от наследственных причин: так, при наличии заболевшего родственника первой линии риск оказывается в 2 раза более высоким, двух и более заболевших — в 5— 10 раз [3].
На ранних стадиях развития РПЖ гормоноза-висим, поэтому одним из способов лечения является гормонотерапия с последующей лучевой терапией; однако часть опухолей резистентна к лечению. Предполагается, что резистентность РПЖ объясняется наличием субпопуляции стволовых раковых клеток, способных к самообновлению, и эти клетки дают начало более дифференцирован-
ным опухолевым клеткам, которые приводят к образованию субпопуляции клеток, резистентных к стандартным методам лечения. Предполагается, что стволовые клетки РПЖ характеризуются экспрессией комбинации маркеров CD133 и CD44; гены, отвечающие за экспрессию этих белков, связаны с инвазивностью, повышенным ме-тастазированием, регуляцией анти- и проапопто-тических путей, активной репарацией ДНК и пр.
[4].
В настоящей работе все исследования проводили на лимфоцитах периферической крови больных РПЖ и здоровых доноров. При этом исходили из предположения о том, что через предстательную железу протекает значительное количество крови. Лимфоциты, постоянно контактирующие с опухолевыми клетками, благодаря эффекту "свидетеля" могут приобретать их свойства, в том числе чувствительность или резистентность к гормонотерапии, лучевому лечению, химиотерапии.
Целью данной работы было изучение свойств лимфоцитов периферической крови больных РПЖ по сравнению с лимфоцитами здоровых доноров, их чувствительность к гормонотерапии, вариабельность свойств у отдельных индивидуумов. Предполагали, что при проведенных экспериментальных исследованиях, возможно, будет выявлен параметр, важный для прогноза успеха лучевого лечения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Всего были исследованы лимфоциты от 13 до 25 больных РПЖ (точное число больных, чьи лимфоциты были исследованы, указано в таблицах), не получавших гормонотерапию, и 30 больных РПЖ после гормонотерапии.
В лимфоцитах больных изучали количественный уровень цитогенетических повреждений — частоту клеток с микроядрами (МЯ), аберрациями хромосом; радиочувствительность (к облучению клеток in vitro в дозе 1 Гр), способность к адаптивному ответу (АО); оксидативный статус — концентрацию активных форм кислорода (АФК). Измеряли количество лимфоцитов, экспрессиру-ющих маркеры активации лимфоцитов (CD69), пролиферации (Ki67) и проапоптотический маркер CD95. Для каждого показателя сравнивали средние значения, индивидуальные значения, определяли возможные коррелятивные связи.
Периферическую кровь от больных и условно здоровых людей забирали в стандартные стерильные пробирки для крови BD Vacutainer с объемом
6 мл, содержащие в качестве антикоагулянта гепарин.
Для проведения анализов отобранный образец крови разделяли на три части: одну часть использовали для измерения спонтанной и индуцированной облучением in vitro поврежденности генома лимфоцитов, вторую часть образца отобранной крови использовали для определения содержания иммунологических маркеров, а третью часть отобранной пробы крови использовали для измерения содержания активных форм кислорода, Таким образом, все измерения проводили параллельно на одном и том же образце крови, полученной от индивидуума.
Определение частоты клеток с аберрациями хромосом
Для проведения метафазного анализа аберраций хромосом лимфоциты цельной крови с гепарином культивировали в среде RPMI с 20%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, с антибиотиками и фитогемагглютинином-П (ФГА-П, 10 мкг/мл) в термостате при 37°С. Для накопления метафаз за 2 ч до окончания инкубации в среду добавляли демеколцин (5 мкг/мл). Через 51 ч после начала культивирования суспензию клеток центрифугировали, гипотонизировали 0.075 моль/л раствором KCl и фиксировали смесью ледяной уксусной кислоты и метилового спирта (1 : 3). Суспензию фиксированных клеток наносили на предметные стекла и высушивали. Полученные препараты окрашивали азур-эози-ном и анализировали 100 метафаз на каждую временную точку. Определяли процент метафаз с аберрациями хромосом, типы аберраций хромосом (нестабильные хромосомные аберрации — дицентрические, кольцевые хромосомы, парные фрагменты и хроматидные аберрации: одиночные фрагменты, симметричные и асимметричные обмены, делеции) и общее число аберраций хромосом на клетку.
Определение частоты клеток с микроядрами
Для измерения спонтанной и индуцированной облучением in vitro поврежденности генома лимфоцитов использовали стандартные методики культивирования лимфоцитов и микроядерный тест с использованием цитохалазина В.
Коротко, гепаринизированную кровь в среде RPMI с 20%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, с антибиотиками и ФГА-П (10 мкг/мл) инкубировали в термостате при 37°С. Через 48 ч после стимуляции в культуру добавляли цитоха-
лазин В (10 мкг/мл) на 24 ч. Через 72 ч от момента введения ФГА клетки обрабатывали гипотоническим 0.125 моль/л раствором КС1, фиксировали в смеси метанол : ледяная уксусная кислота (3 : 1) и наносили на предметные стекла. Высохшие мазки окрашивали азур-эозином. На каждом стекле подсчитывали число двуядерных клеток с микроядрами на 1000 двуядерных клеток, т.е. в клетках, прошедших первый митоз между 48 и 72 ч после стимуляции ФГА.
Определение радиочувствительности
Для определения радиочувствительности лимфоцитов периферической крови через 48 ч после стимуляции ФГА их подвергали острому воздействию у-излучения 60Со в дозе 1 Гр на установке "Луч 1" (Россия) с мощностью дозы 20 сГр/мин. Эффект оценивали по частоте клеток с МЯ.
Для изучения адаптивного потенциала стимулированные ФГА лимфоциты крови облучали сначала в адаптирующей дозе 0.05 Гр в стадии G1 (через 24 ч после стимуляции ФГА), а через 48 ч после стимуляции, в стадии G2, в разрешающей дозе 1.0 Гр. Определяли частоту клеток с МЯ при облучении в адаптирующей (0.05 Гр) и повреждающей дозе (1 Гр) по сравнению с эффектом облучения только в повреждающей дозе. Облучение проводили на 60Со у-установке "Луч 1" при мощности дозы 0.12 сГр/мин. Подробно методика описана в работе [5]. Достоверность различий вычисляли при помощи критерия х2. По результатам сравнения каждый индивидуум относили к одной из четырех групп: индивидуумы с достоверным адаптивным ответом или с достоверным повышением радиочувствительности (х2 > 3.84), обозначаемые далее как индивидуумы с АО или ДПР соответственно, и индивидуумы с недостоверным адаптивным ответом или с недостоверным повышением радиочувствительности (х2 < 3.84), обозначаемые далее как индивидуумы с НДА или НДПР соответственно.
Измерение содержания CD69-, CD95-
и Ш67-положительных лимфоцитов
Вторую часть образца отобранной крови использовали для определения содержания указанных выше
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.