научная статья по теме СВЯЗЫВАНИЕ -ЭНДОРФИНА И ЕГО ФРАГМЕНТОВ С НЕОПИОИДНЫМ РЕЦЕПТОРОМ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ МЫШИ Химия

Текст научной статьи на тему «СВЯЗЫВАНИЕ -ЭНДОРФИНА И ЕГО ФРАГМЕНТОВ С НЕОПИОИДНЫМ РЕЦЕПТОРОМ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ МЫШИ»

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2008, том 34, № 1, с. 36-42

УДК 577.112.6.016:577.354.3

СВЯЗЫВАНИЕ Р-ЭНДОРФИНА И ЕГО ФРАГМЕНТОВ С НЕОПИОИДНЫМ РЕЦЕПТОРОМ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ

МАКРОФАГОВ МЫШИ

© 2008 г. Ю. А. Ковалицкая*, В. Б. Садовников*, А. А. Колобов**, Ю. А. Золотарев***, В. В. Юровский****, В. М. Липкин*, Е. В. Наволоцкая*#

*Филиал Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290, Московская обл., г. Пущино, просп. Науки, 6;

**ГНЦГосударственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов,

Санкт-Петербург;

***Институт молекулярной генетики РАН, Москва;

****Факультет нейрохирургии университета Мэриленд, Балтимор, США

Поступила в редакцию 16.04.2007 г. Принята к печати 08.05.2007 г.

Получен меченный тритием селективный агонист неопиоидного (не чувствительного к опиоидному антагонисту налоксону) рецептора Р-эндорфина декапептид иммунорфин ([3H]SLTCLVKGFY), удельная активность 24 Ки / ммоль. Показано, что [3Н]иммунорфин с высоким сродством связывается с неопиоидным рецептором в-эндорфина перитонеальных макрофагов мыши (^ 2.4 ± 0.1 нМ). Специфическое связывание [3Н]иммунорфина с макрофагами ингибировал немеченый в-эндорфин (К комплекса [3Н]иммунорфин-рецептор 2.9 ± 0.2 нМ) и не ингибировали немеченые налоксон, а-эндорфин, у-эндорфин и [Met5]энкефaлин (К > 10 мкМ). Синтезировано 30 фрагментов в-эндорфина и исследована их способность ингибировать специфическое связывание [3Н]иммунорфина с макрофагами. Установлено, что самым коротким пептидом, обладающим практически такой же ингибирующей активностью, что и в-эндорфин, является его фрагмент 12-19 (К 3.1 ± 0.3 нМ).

Ключевые слова: в-эндорфин, пептиды, рецепторы, макрофаги.

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что в-эндорфин связывается как с опиоидными (ц и 5) [1], так и с неопиоидными (нечувствительными к опиоидному антагонисту налоксону) рецепторами [2]. Структура и функции последних до настоящего времени практически не изучены.

В 1980 г. Джулиард и соавт. обнаружили в составе тяжелой цепи человека кортикотро-пин- и в-эндорфинподобные последовательности [3]. Хоук и соавт. синтезировали тетрадекапептид SLTCLVKGFYPSDI, соответствующий в-эндор-финподобной последовательности (фрагмент 364-377 СН3-домена тяжелой цепи) и показали, что он конкурирует с 1251-меченным в-эндорфи-ном за связывание с мембранами головного мозга крысы [4]. Мы синтезировали в-эндорфинподоб-ный декапептид SLTCLVKGFY (авторское название пептида - иммунорфин), соответствующий последовательности 364-373 тяжелой цепи

Сокращения: Con A - конканавалин A; IgG - иммуноглобулин G; РАМ - фенациламидометил. # Автор для связи (тел.: (4967) 73-66-68; факс: (4967) 33-05-27; эл. почта: navolots@fibkh.serpukhov.su).

подклассов 1-4 человека [5], и установили, что он является селективным агонистом неопиоидного (нечувствительного к налоксону) рецептора Р-эндорфина T-лимфоцитов человека [6-9], перитонеальных макрофагов мыши [10, 11], синаптиче-ских мембран головного мозга крысы [12], а также клеток человеческой T-лимфобластной линии Jurkat [13]. Исследование биологической активности иммунорфина показало, что он увеличивает индуцированную конканавалином А пролиферацию T-лимфоцитов человека in vitro [6-9], активирует перитонеальные макрофаги мыши in vitro и in vivo [10, 11], стимулирует рост человеческих T-лимфобластных клеточных линий Jurkat и MT-4 [13, 14], ингибирует активность аденилатциклазы мембран коры надпочечников крысы и подавляет секрецию глюкокортикоидов из надпочечников в кровь [15], стимулирует процессы клеточного деления ранних эмбрионов мыши, образование и "выклевывание" зрелых бластоцист in vitro [16, 17]. Исследование распределения неопиоидного рецептора Р-эндорфина в организме крысы показало, что он имеется на клетках иммунной (макрофаги и лимфоциты), нервной (синаптические мембраны головного мозга), эндокринной (мембраны коры

надпочечников) и сердечно-сосудистой (мембраны миокарда) систем [18].

Цель настоящей работы - исследование способности немеченых синтетических фрагментов Р-эн-дорфина ингибировать специфическое связывание [3Н]иммунорфина с перитонеальными макрофагами мыши и определение фрагмента наименьшей длины, способного с высоким сродством связываться с не-опиоидным рецептором Р-эндорфина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Последовательности синтезированных пептидов приведены в таблице.

С помощью реакции высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена после очистки получено 2 мКи [3Н]иммунор-фина с удельной активностью 24 Ки / ммоль. Время удерживания [3Н]иммунорфина и немеченого иммунорфина на колонке Кгоша8П С18 (условия хроматографии приведены в разделе "Эксперимент. часть") совпадало и составляло 18 мин; отношения мол. коэффициентов поглощения при 254 и 280 нм для меченого и немеченого пептида также совпадали, что свидетельствует о сохранении химического строения иммунорфина при замещении водорода на тритий.

Проведенные эксперименты показали, что в выбранных нами условиях (см. "Эксперимент. часть") [3Н]иммунорфин специфически связывается с пери-тонеальными макрофагами мыши. Величину специфического связывания [3Н]иммунорфина определяли по разности между его общим и неспецифическим связыванием. Величину неспецифического связывания [3Н]иммунорфина оценивали в присутствии 10-4 М немеченого иммунорфина, оно составляло 9.7 ± 0.5% от общего связывания меченого пептида. Из рис. 1а видно, что динамическое равновесие в системе [3Н]иммунорфин-рецептор устанавливалось через 1 ч и сохранялось, по крайней мере, 2 ч, поэтому реакцию связывания [3Н]иммунорфина с макрофагами проводили в течение 1 ч.

Анализ специфического связывания [3Н]имму-норфина с макрофагами в координатах Скэтчарда (рис. 16) показал, что на их поверхности имеется один класс участков связывания (рецепторов) этого пептида - график представляет собой прямую линию. Величина Кл, равная 2.4 ± 0.1 нМ, свидетельствует о высоком сродстве иммунорфина к рецептору. Плотность рецепторов - количество мест специфического связывания меченого пептида в расчете на 1 макрофаг - составила 27780 ± 560.

Для характеристики специфичности связывания [3Н]иммунорфина с макрофагами в качестве потенциальных конкурентов были протестированы немеченые налоксон, а-, Р-, у-эндорфины и [Мй5]энкефалин. Результаты экспериментов показали, что только Р-эндорфин активно ингиби-

(а)

Специфическое связывание [3И]иммунорфина, имп./мин

Время, мин

(б)

В/¥ 0.25 -

0.05 -

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

В, нМ

Рис. 1. Специфическое связывание [3Н]иммунорфина с перитонеальными макрофагами мыши. (а) - Зависимость от времени инкубации. Величину специфического связывания меченого пептида определяли как разность между его общим и неспецифическим связыванием. (•) - Анализ в координатах Скэтчарда (В и ^ - молярные концентрации связанного и свободного меченого пептида соответственно).

ровал связывание [3Н]иммунорфина с макрофагами: К 2.9 ± 0.2 нМ. Налоксон и остальные пептиды были не активны: К > 10 мкМ. Таким образом, иммунорфин и Р-эндорфин с высоким сродством и специфичностью связываются с общим, не чувствительным к налоксону, рецептором перитоне-альных макрофагов мыши.

Еще в начале 80-х годов прошлого века исследователи Р-эндорфина отмечали, что действие

Ингибирование фрагментами Р-эндорфина и немечеными аминокислотами специфического связывания [3И]им-мунорфина (ЗЬТСЬУКОРУ) с перитонеальными макрофагами мыши

Пептид Фрагмент Р-эндорфина Молекулярная масса (МраСч), Б 1С50, нМ ± стандартное отклонение Кг нМ ± стандартное отклонение

Р-Эндорфин 1129.3 (1130.0) 8.9 ± 0.5 2.9 ± 0.2

здТРЬУгъгычАп 10- 23 1543.6 (1544.99) 9.3 ± 0.6 3.0 ± 0.2

дТРЬУгъгычАп 11- 23 1456.9 1457.9) 9.4 ± 0.7 3.0 ± 0.2

ЗОТРГУТРГИЧА! 10- 22 1432.4 1431.82) 9.3 ± 0.6 3.0 ± 0.2

дТРГУТГГЮЧА1 11- 22 1345.9 (1347.73) 9.2 ± 0.8 3.0 ± 0.2

ТРЬУТЪГЫЧАП 12- 23 1324.8 (1326.73) 9.4 ± 0.5 3.0 ± 0.2

ЗОТРГУТРГИЧА 10- 21 1319.6 (1318.65) 9.5 ± 0.8 3.1 ± 0.3

ТРГУТТГЮЧА 12- 21 1102.5 (1103.43) 9.2 ± 0.6 3.0 ± 0.2

ОТРГУТРГИЧА 11- 21 1232.0 1231.56) 9.3 ± 0.8 3.0 ± 0.3

ТРРУТТГККА1 12- 22 1214.9 1216.6) 9.3 ± 0.8 3.0 ± 0.3

РЬУТЪГКЧАП 13- 23 1226.2 1228.65) 13.2 ± 0.9 4.3 ± 0.3

РРУТРГККА1 13- 22 1116.9 1115.48) 13.6 ± 0.9 4.4 ± 0.3

РРУТРГККА 13- 21 1000.4 (1002.31) 13.4 ± 0.7 4.3 ± 0.3

РРУТРГКК 13- 20 932.7 931.22) 13.7 ± 0.8 4.4 ± 0.3

БОТРРУТРГИЧ 10- 20 1246.0 (1247.56) 9.3 ± 0.5 3.0 ± 0.2

ОТРРУТРГИЧ 11- 20 1162.1 (1160.47) 9.3 ± 0.6 3.0 ± 0.2

ТРРУТРГЮЧ 12- 20 1033.8 (1032.34) 9.2 ± 0.6 3.0 ± 0.2

БОТРРУТРГК 10- -19 1130.2 (1133.46) 9.5 ± 0.7 3.1 ± 0.3

ОТРРУТТГК 11- -19 1043.5 (1046.37) 9.6 ± 0.8 3.1 ± 0.3

ТРГУТГГК 12- -19 918.9 918.24) 9.5 ± 0.9 3.1 ± 0.3

РГУТГГК 13- -19 818.2 817.12) 158.6 ± 12.7 51.2 ± 4.1

ГУТГГК 14- -19 720.4 719.99) 248.6 ± 20.0 80.2 ± 7.2

УТГГК 15- 19 606.0 606.82) 976.6 ± 78.4 315.0 ± 25.2

ТГГК 16- 19 508.5 (507.67) 1422.4 ± 127.9 458.8 ± 36.7

ГГК 17- 19 405.7 406.55) 1500.9 ± 128.6 484.2 ± 38.7

ГК 18- 19 293.6 (293.38) 1934.1 ± 174.1 623.9 ± 52.0

БОТРРУТРГ 10- 18 1045.8 1046.31) 125.5 ± 10.0 40.5 ± 3.2

ОТРГУТГГ 11- 18 917.7 918.18) 127.4 ± 10.2 41.1 ± 3.3

ТРГУТГГ 12- 18 790.2 (790.06) 128.6 ± 10.3 41.5 ± 3.4

РГУТГГ 13- 18 686.8 (688.93) 318.7 ± 10.3 102.8 ± 25.4

БОТРГУТГ 10- 17 860.0 858.08) >10000 >10000

Ь-РЬе - >10000 >10000

- >10000 >10000

пептида на иммунокомпетентные клетки в ряде случаев не зависит от присутствия налоксона и следовательно не опосредовано через опиоидные рецепторы [1]. Впервые неопиоидный (не чувствительный к опиоидному антагонисту налоксону) рецептор Р-эндорфина был выявлен Хазумом и со-авт. [2] на трансформированных лимфоцитах человека. Исследование специфичности рецептора показало, что он не связывает а- и у-эндорфины, [Met5]- и [Ьеи5]энкефалины, Р-липотропин, корти-котропин, а-меланоцитстимулирующий гормон, инсулин и глюкагон.

Практически одновременно несколько групп ученых обнаружили способность Р-эндорфина влиять на пролиферацию Т-лимфоцитов in vitro (сообщалось как о стимулирующем, так и об ин-гибирующем эффектах) [19-21]. Пытаясь выяснить причину столь существенных различий, Ван

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»