БИООРГл НИ ЧЕСКА Я ХИМИЯ, 1995, том 21, № /, с 17 - 23
УДК 579.84:577.' 12'514.6+61 ti.097.612.017+547.458.22:118.057
СВЯЗЫВАНИЕ ПОРИНА С ЛИПОПОЛИСАХАРИДОМ
ИЗ Yersinia pseudotuberculosis
© 1995 г. Л. И. Федореева, Т. Ф. Соловьева
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РЛН, 690022, Владивосток, пр. 100-летия Владивостока, 159 Поступила в редакцию 26.01.94 г. После доработки 19.04.94 г.
Исследовано взаимодействие белка порина из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis с ли-пидом А, R-ЛПС и S-ЛПС из того же микроорганизма с использованием методов КД-спектроскопии, собственной белковой флуоресценции, дифференциальной сканирующей микрокалориметрии и ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Установлено, что связывание белка с лигандами протекает специфично и сопровождается изменениями в кон формации порина. Характер взаимодействия порина с лигандом изменяется по мере усложнения молекулы последнего: липид А —R-ЛПС —»- S-ЛПС. Для липида А на белке имеются два независимых центра связывания с KdC 6.1 х 104 М-1. R- и S-ЛПС взаимодействуют с порином соответственно с отрицательной и положительной кооиеративностью. Возможные механизмы ко оперативности обсуждаются.
Ключевые слова: порин, липополисахарид, связывание.
Л и по п о л ис а х ари д (Л ПС) и порообразующие тримерные белки (порины) являются основными компонентами наружной мембраны грамотрица-тельных бактерий [1]. Они специфически взаимодействуют между собой, образуя прочные комплексы. Эти комплексы играют важную роль в поддержании стабильности мембраны и в ее функционировании [2, 3]. Взаимодействие пори-нов с ЛПС занимает особое место в процессе их сборки в наружной мембране. Высказываются предположения, что после отщепления сигнальной последовательности мономер порина связывает вновь синтезированный ЛПС. Образование комплекса инициирует изменения в конформа-ции порина, которые приводят к тримеризации, и перенос его в наружную мембрану [4, 5]. Однако этот процесс в настоящее время остается практически не исследованным.
В этой связи представляет интерес изучение связывания с. ЛПС денатурированного мономера, который в основном сохраняет вторичную структуру нативного порина и отличается от него третичной и четвертичной структурами. Данному вопросу посвящена предлагаемая работа.
Мономерная форма порина была получена из эндотоксина - липополисахарид-белкового комплекса (ЛПБК), выделенного из наружной мембраны псевдотуберкулезного микроба [61. Ранее
К-ЛПО - липополисахарид, молекула которого состоит из олигосахарнда кора и линмда А; 5-ЛПС - липополисахарид, молекула которого состоит из О-слецифического полисахарида, олигосахарида кора и липида А; ЛПБК - липо-полисахарид-белковый комплекс, или эндотоксин.
было показано, что в составе ЛПБК порин существует в тримерной форме [7]. В условиях отделения порина от ЛПС (90°С, рН 4.5) происходит диссоциация тримера и частичная денатурация мономера [8]. Молекулярная масса мономерной формы белка, по данным аминокислотного анализа, равна 36 5 кДа.
Методом кругового дихроизма (КД) обнаружено, что добавление ЛПС к белку приводит к изменениям в спектре последнего: максимум отрицательной полосы смещается в длинноволновую сторону и увеличивается молярная эллиптичность (рис. 1а).
При сравнении спектров КД белка и комплекса белок-ЛПС необходимо учитывать вклад амидных хромофоров ЛПС. Сложение спектров белка и ЛПС не приводит к искомому спектру КД искусственного комплекса (рис, 16). Наблюдаемые изменения в спектрах КД комплекса ЛПС-белок нельзя объяснить вкладом амидных хромофоров ЛПС. Следовательно в белке зультате связывания происходят конформацион-ные превращения.
Увеличение молярной эллиптичности спектра КД белка находится в прямой зависимости от количества добавленного ЛПС в пределах 0.5 - 6 моль ЛПС на 1 моль белка. Дальнейшее увеличение количества ЛПС (до соотношения 9 моль ЛПС на 1 моль белка) не вызывает изменений в спектрах КД, что свидетельствует, видимо, о насыщении мест связывания при соотношении ЛПС - белок
Рис. 1, Спектры КД изолированного белка (/) и комплекса Э-ЛНС-белок в молярном соотношении I : 1 (2), 3 : 1 (3), 6 : I (4), 9:1 (5) (а). Концентрация соединений 0.2 мг/мл в 1 мл 0.05 М трис-НС1-буфера, рН 8.4, содержащего 1 мкл три-этиламина. б - учет амидных хромофоров комплекса Б-ЛПС-белок: I - изолированный белок (0.2 мг/мл), 2 - 8-ЛПС (0.1 мг/мл), 3 - комплекс в-Л! 1С-белок (6:1, моль/моль, 0.8 мг/мл), 4 - спектр, полученный сложением спектров / и 2.
около 6:1, моль/моль, и тем самым о специфичности взаимодействия.
Изменения в содержании элементов вторичной структуры в белке при его взаимодействии с Л ПС были определены по методу Болотиной [9]. Согласно анализу спектров КД, белок высоко р-структурирован: общее содержание Р-складча-тых листов и (3-изгибов составляет около 80% (таблица). В белке отсутствуют а-спирализован-ные участки и до 20% приходится на неупорядоченную конформацию. При добавлении ЛПС наблюдается увеличение содержания неупорядоченной структуры, и при соотношении белок - ЛПС 1 : 6, моль/моль, появляется небольшое количество а-спирали. Таким образом, связывание с ЛПС вызывает раскручивание некоторых ^-структурированных участков полипептидной цепи, скорее всего находящихся вблизи мест связывания. Как видно из таблицы, порин в составе эндотоксина имеет до 36% неупорядоченной конформации. Возможно, увеличение доли неупорядоченной структуры в белке при комплексовании с Л П С свидетельствует о его частичной ренатурации.
Содержание элементов вторичной структуры в поро-образующем белке и в его комплексах с ЛПС
Соединение О.-Спи-раль р-Стру-ктура Р-Из-гиб Другие
ЛПБК 0.0 50.2 13.1 36.7
Белок 0.0 66.1 13.5 20.4
Белок-ЛПС, 1 1 0.0 65.4 11.6 23.0
» 1 3 0.0 61.3 13.2 25.5
» 1 6 0.1 59.6 9.8 30.5
По данным метода собственной белковой флуоресценции, взаимодействие с ЛПС сопровождается также изменениями в третичной структуре белка. Спектр излучения белка имеет максимумы при 307 и 338 нм при возбуждении светом с длиной волны 280.4 и 296.7 нм соответственно.
Как следует из анализа суммарного спектра флуоресценции белка в терминах модели дискретных состояний остатков ароматических аминокислот [10], основной вклад в спектр вносят остатки тирозина, вклад остатков триптофана незначителен и представлен в основном спектральными классами 1 и III (рис. 2а). Такой характер излучения белка, видимо, обусловлен отсутствием переноса энергии с тирозиновых остатков на триптофапо-вые и сильным тушением последних. При образовании комплекса белок-ЛПС (1:6, моль/моль) максимум спектра смещается в длинноволновую область на 7 нм, появляются трпптофановые остатки спектрального класса II, находящиеся в окружении связанной воды, которые отсутствуют в изолированном белке, а вклад в излучение остатков тирозина и интенсивность флуоресценции уменьшается (рис. 26). При этом максимум спектра триптофановой флуоресценции белка не изменяется.
Можно предположить, что два остатка триптофана в белке находятся в разном микроокружении. Один из остатков расположен на поверхности белковой глобулы, другой - в гидрофобном окружении. При добавлении ЛПС к белку наблюдается "разрыхление" жесткой структуры последнего. Молекулы воды проникают в глубь белковой глобулы, в результате микроокружение остатков триптофана, находящихся в гидрофобном окружении, изменяется на более полярное.
Как следует из рис. 26, порин в составе ЛПБК имеет локальную третичную структуру, отличную
л
4
5
о О
х
300 320 340 360 380 300 320 340 360 380 им
Рис. 2. Анализ спектров собственной флуоресценции на основе дискретных состояний остатков триптофана в белках: изолированного белка (а) и комплекса S-ЛПС-белок (6:1. моль/моль) (б): 1 - общий вид спектра, 2 - вклад остатков тирозина, вклад остатков триптофана спектральных классов [14]: S (J), 1 (4), II (5), 111 (6). Концентрация соединений 0.1 мг/мл в 0.05 М трис-НСЛ-буфере, рН 8.4.
л
I-
а к
(С S
и щ
н э: К к га ж
л ^
i>
0.6 0.4 0.2
/ о-о-сг
5
3 2
Рис. 4. Зависимость от температуры вкладов в спектр флуоресценции поршта остатки!! тирозина (/) и трип-тофановых остатков спектральных классов S (2), 1 (J), II (4), III (5).
20 30 40 50 60 70 80 °С
Рис. 3. Термограммы: / - изолированного белка (I мг/мл), 2 - 8-ЛПС (0.2 мг/мл), 3 - комплекса -ЛПС-белок (2.2 мг/мл, 6:1, моль/моль). Препараты были растворены в 0.05 М трис-НС1-буферс, рН 8.4, содержащем 1 мкл триэтиламина.
от таковой как в изолированном белке, так и в реконструированном комплексе.
Таким образом, при связывании с ЛПС третичная структура белка подвергается изменению, однако восстановления нативной конформации не происходит.
Образование комплекса между белком и ЛПС было подтверждено дифференциальной сканирующей микрокалориметрией. При нагревании смеси белок-ЛПС (1:6, моль/моль) происходит экзотермический переход при 45°С (рис. 3). В этой температурной области пе найдено структурных переходов ни для изолированного белка, ни для свободного ЛПС. Для ЛПС отмечен экзотермический переход в области 80°С, а для изолированного белка - эндотермический переход при 32°С.
Данные собственной белковой флуоресценции (рис. 4) подтверждают, что термопереход, обна-
руженный микрокалориметрией, связан с образованием комплекса Л ПС-белок. Действительно, этот процесс осуществляется с изменением конформации белка, которое выражается в появлении трипгофановых остатков спектрального класса II, характерных для реконструированного комплекса.
Изучение комплексообразования между ЛПС и белком было проведено также методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия (рис. 5). Было установлено, что насыщение порина наступает при соотношении белок - ЛПС I : 3, моль/моль. В этом случае ЛПС и белок обнаруживаются в одной зоне плотности, равной 1.405 г/см3. При других соотношениях компонентов наряду с комплексом были обнаружены свободные белок и ЛПС. Различия в составе комплексов Л ПС-белок, рассчитанные
4 8 12 16 Номер фракций
Рис. 5. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности СвС!: 1 - изолированного белка (
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.