ш
УДК 577.112.824:615.917
СЫВОРОТОЧНЫЙ АЛЬБУМИН: ПОИСК НОВЫХ САЙТОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ НА ПРИМЕРЕ ЗОМАНА
© 2014 г. Д. А. Белинская*, #, В. И. Шмурак**, Д. С. Прокофьева**, Н. В. Гончаров*, **
*ФГБУНИнститут эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, 194223 Россия, Санкт-Петербург, проспект Тореза, 44 ** ФГУП "НИИгигиены, профпатологии и экологии человека" ФМБА России, Санкт-Петербург Поступила в редакцию 17.02.2014 г. Принята к печати 02.04.2014 г.
Известно, что альбумин может взаимодействовать с фосфорорганическими соединениями (ФОС). Однако окончательно не установлены остатки аминокислот альбумина, отвечающие за это взаимодействие, природа образующихся при этом связей, обсуждаются каталитические и псевдокаталитические функции альбумина. Методами молекулярного моделирования выявлены возможные сайты взаимодействия альбумина с зоманом. Структуры комплексов зомана с альбумином определяли методом молекулярного докинга, стабильность полученных комплексов рассчитывали методом молекулярной динамики. Установлено, что образование химической связи зомана с остатком тирозина-411 происходит только при условии депротонирования последнего. Другой остаток — тирозин-150 в альбумине эффективнее связывает зоман, чем остаток тирозина-411. При этом депротонирование остатка тирозина-150 не определяет эффективность в момент связывания (сорбции) зомана, а влияет на стабильность образуемой связи. Предполагается, что остатки тирозина-150 и серина-193 альбумина могут служить сайтами каталитического взаимодействия с зоманом. Выдвинута гипотеза о влиянии депротонирования остатка аминокислоты в одном сайте альбумина на инициирование связывания лиганда в другом сайте (аллостерическая регуляция) альбумина.
Ключевые слова: альбумин, зоман, молекулярный докинг, молекулярная динамика.
DOI: 10.7868/S0132342314050030
ВВЕДЕНИЕ
Альбумин — преобладающий белок плазмы крови. Молекула альбумина, в отличие от молекул других плазменных белков, не покрыта углеводной оболочкой, поэтому белок может связывать различные молекулы эндогенного и экзогенного происхождения (воду, ионы металлов, жирные кислоты, многие лекарства и токсины, например, аспирин, варфарин, клофибрат, фенитоин) [1]. Ранее альбумин рассматривался лишь как транспортный белок, который, связываясь нековалентно с лигандами, доставляет их к тканям-мишеням или к местам дальнейшей биотрансформации. Но в 1959 г. было установлено, что альбумин способен расщеплять сложноэфирные связи в низкомолекулярных соединениях [2]. Необходимо различать эстеразную
Сокращения: КЭ — карбоксилэстераза; ФОС — фосфорор-ганические соединения; RMSD — Root-mean-square deviation (среднеквадратичное отклонение). # Автор для связи (тел.: +7 (921) 580-69-19, +7 (812) 552-3256; эл. почта: d_belinskaya@mail.ru).
и псевдоэстеразную активность альбумина. В первом случае происходит связывание субстрата с "активным центром" и последующий относительно быстрый гидролиз эфирной связи субстрата. Во втором случае осуществляется необратимое связывание эфирного субстрата с аминокислотными остатками на поверхности альбумина с образованием долгоживущего ковалентного аддук-та. Характерный пример псевдоэстеразной активности альбумина — расщепление ацетиловых эфиров (напр., аспирина) с последующим ацетилированием различных аминокислотных остатков альбумина. В ходе ацетилирования убыль субстрата обусловлена образованием долгоживущих ковалентных ад-дуктов между ацетильной группой субстрата и многочисленными аминокислотными остатками на поверхности альбумина [3].
В ряде работ была показана (псевдо)эстераз-ная активность альбумина по отношению к разным субстратам: 1-нафтилацетату, 1-нафтил-^-метилкарбамату, я-нитрофенилацетату [2, 4], эфирам жирных кислот [5], аспирину [3, 6], глю-
курониду кетопрофена [7], циклофосфамиду [8], эфирам никотиновой кислоты [9], октаноилгре-лину [10], нитроацетанилиду [11], нитротри-фторацетанилиду [12]. Также была продемонстрирована (псевдо)эстеразная активность альбумина по отношению к некоторым ФОС, таким как тиофос, параоксон [13, 14], зоман, зарин [15], циклозарин, табун и RVX [16, 17].
Однако до сих пор остается невыясненным вопрос, какие именно аминокислоты альбумина отвечают за эстеразную и псевдоэстеразную активность. Методом масс-спектрометрии были определены 82 а.о. альбумина, которые могут быть ацетилированы я-нитрофенилацетатом: 59 Lys, 10 Ser, 8 Thr, 4 Tyr и 1 Asp [18]. Авторы исследования показали, что максимально эффективно молекула я-нитрофенилацетата связывается с остатком Tyr411. Высокая реактивность этой аминокислоты обусловлена пространственной близостью остатка Arg410, который ослабляет связь —Н—О тирозина и тем самым повышает его нуклефильную активность. Отмечена высокая консервативность остатков Tyr411 и Arg410 в альбуминах млекопитающих, что свидетельствует об их взаимодействии и взаимовлиянии [15].
Масс-спектрометрические исследования показали, что остаток Tyr411 (далее сайт Tyr411) является сайтом связывания для таких фосфорорга-нических эфиров как зоман, зарин, циклозарин и табун [13]. Однако не исключается возможность существования дополнительных сайтов взаимодействия альбумина с ФОС [16], так как с помощью масс-спектрометрических методов можно установить лишь относительно долгоживущие ковалент-ные аддукты, и оценить данные методы могут только псевдоэстеразную активность белка. Истинные фермент-субстратные комплексы быстро распадаются в ходе ферментативной реакции и не поддаются детектированию методами масс-спектро-метрии.
Цель представленной работы — выявить возможные сайты взаимодействия альбумина с зома-ном и оценить возможность ферментативной реакции в этих сайтах. Для этого методами молекулярного моделирования было исследовано связывание альбумина с зоманом. Зоман был выбран для расчетных экспериментов по двум причинам. Одна из них имеет главным образом прикладной характер и связана с тем, что у человека сывороточный альбумин может выступать в качестве основного белка крови, неспецифически связывающего и гидролизующего некоторые ФОС, в частности высокотоксичный зоман, в отличие, например, от грызунов, у которых активным участником токсикокинетики зомана является карбоксилэс-тераза (КЭ) плазмы крови [19]. Учитывая большие запасы зомана в Российской Федерации, которые еще предстоит уничтожить согласно меж-
дународной Конвенции 1993 г., представляется важным разрабатывать новые методы диагностики, профилактики и лечения персонала объектов по уничтожению химического оружия при вероятном отравлении. Другая причина — значительное количество экспериментальных данных о взаимодействии альбумина и других эстераз с оптическими изомерами зомана, что позволило использовать зоман в качестве модельного соединения для изучения (псевдо)эстеразной активности альбумина. В частности, было установлено, что фосфонилирование альбумина зоманом по сайту Туг411 идет очень медленно (константа скорости 15 М-1 мин-1), спонтанная реактивация (фосфо-триэстеразная активность альбумина) также происходит чрезвычайно медленно (0.0044 ч-1), так что образовавшийся аддукт довольно стабилен (^/2 = 6.5 сут). Однако по количеству образуемого в ходе взаимодействия с зоманом фторид-иона была обнаружена довольно значительная дополнительная гидролитическая активность альбумина, объяснение которой не найдено и количественный вклад которой не оценен должным образом. Это позволяет сделать предположение, что Туг411 обусловливает псевдоэстеразную активность альбумина по отношению к зоману, в то время как истинно ферментативный гидролиз зо-мана происходит в другом сайте или сайтах альбумина. На эту роль может претендовать Туг150, так как масс-спектрометрическими методами был обнаружен аддукт с альбумином по Туг150 другого высокотоксичного ФОС — вещества типа УХ [20]. Кроме того, установлено, что Туг411 образует устойчивые ковалентные аддукты преимущественно с агентами G-типа (зарин, зоман), а Туг150 — с агентами У-типа [17]. На основании этих данных аминокислотные остатки Туг411 и Туг150 были выбраны в качестве основных для исследования взаимодействия альбумина с зоманом методами молекулярного моделирования. Известно, что для продуктивного связывания молекул субстратов и необратимых ингибиторов в активном центре холинэстераз необходима активация аминокислот каталитической триады, в ходе которой происходит переход протона с гидроксила серина на ими-дазольное кольцо каталитического гистидина [21]. Мы предположили, что аналогичный перенос протона необходим и при связывании зомана с альбумином. Поэтому для процедуры молекулярного докинга мы использовали два состояния процесса протонирования остатков тирозина по положениям 150 и 411: протонированное (1, неактивированное) и депротонированное (2, активированное). При анализе ближайшего окружения аминокислотных остатков Туг411 и Туг150 были выбраны аминокислотные остатки Lys414 и Ш8242, соответственно, в качестве акцепторов протонов от этих остатков тирозина. Был проведен молекулярный докинг изомеров зомана в эти
(а) (в)
Рис. 1. Р(+)С(—)-стереоизомер зомана, сорбированный в сайтах альбумина "Туг411" (а, б) и "Туг150" (в, г) в состояниях протонирования 1 (а, в) и 2 (б, г).
сайты при различном состоянии протонирования тирозинов, стабильность полученных комплексов проверена методом молекулярной динамики [22].
В настоящей работе представлены результаты поиска альтернативных сайтов взаимодействия альбумина с зоманом, выдвинуто предположение о существовании сайтов, которые могут быть ответственны за эстеразную активность альбумина.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Связывание зомана в сайтах "^уМН" и " Tyr150' альбумина человека
Зоман представляет собой смесь четырех сте-реоизомеров. Пары энантиомеров зомана (С(+)Р(+) и С(—)Р(—); С(+)Р(—) и С(—)Р(+)) представлены в синтетическом С(±)Р(±) зомане в соотношении 45 : 55, с эквивалентным количе-
(а)
(б)
400 600 Время, пс
— Р(-)С(-) Р(+)С(-)
.....Р(-)С(+)
Р(+)С(+)
1000
1.4
1.2
§ 1.0 я
С? 0.8 ¿0.6 I 0.4 0.2
0
10
Время, пс — Р(-)С(-) Р(+)С(-) Р(-)С(+) Р(+)С(+)
15
20
Рис. 2.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.