ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 1, с. 5-17
ОБЗОРНЫЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СТАТЬИ
УДК 575.224:581.602.6
Т-ДНК-ИНДУЦИРОВАННЫЕ МУТАЦИИ У ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ
© 2007 г. Е. В. Дейнеко, А. А. Загорская, В. К. Шумный
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090; факс: (383) 333-12-78; e-mail: deineko@bionet.nsc.ru
Поступила в редакцию 15.02.2006 г.
Обобщены экспериментальные данные по изменению отдельных признаков у генетически модифицированных (трансгенных) растений. Основное внимание уделено рассмотрению мутаций, индуцированных инсерциями Т-ДНК при агробактериальной трансформации двудольных растений. Проанализирована природа возникновения мутаций у трансгенных растений, рассмотрены перспективы использования мутаций, индуцированных Т-ДНК-инсерциями.
Технологии создания трансгенных растений основаны на переносе в растительный геном генов из различных гетерологичных систем (вирусов, микроорганизмов, животных, человека), объединенных в составе генетических конструкций методами генной инженерии. Спектр практического применения генетически модифицированных растений достаточно широк - от улучшения хозяйственно-ценных признаков важных сельскохозяйственных культур [1] до использования их для биоремидиации загрязненных территорий [2-4], а также в качестве "биореакторов" для накопления биологически активных веществ и белков медицинского назначения [5, 6].
В настоящее время разработаны два подхода, с помощью которых чужеродные гены в виде фрагментов экзогенной ДНК могут быть доставлены в растения. Один из них связан с непосредственным переносом экзогенной ДНК в клетки растения (методы прямой трансформации). Второй подход основан на природной способности почвенных бактерий Agrobacterium tumefaciens и А. rhizogenes инфицировать растительные ткани и переносить в геном растения собственные гены, продукты экспрессии которых необходимы для колонизации растительных тканей бактериями. При интеграции фрагментов бактериальной дНк (Т-ДНК) в функционально-активные районы растительного генома может изменяться функционирование собственных генов растения.
Первые мутации, индуцированные внедрением Т-ДНК в растительный геном, были получены у Arabidopsis ^аНапа группой исследователей под руководством К. Фельдманна [7]. В настоящее время данная коллекция Т-ДНК-индуцированных мутаций является наиболее обширной [8, 9].
Спектр описанных в литературе Т-ДНК-инду-цированных мутаций достаточно широк. Известны мутации, затрагивающие как отдельные мор-
фологические признаки - высоту растений [7, 10, 11], размеры и форму листовых пластинок [12, 13], структуру цветка [14-16], так и формирование мужского и женского гаметофитов, приводящие к снижению фертильности [17-23], а также нарушающие развитие зародышей на ранних стадиях [24-28], и мутации, обеспечивающие трансформантам устойчивость к агробактериаль-ному заражению [29-33]. Необходимо подчеркнуть, что подавляющая часть Т-ДНК-мутаций выявлена среди трансгенных растений A. thaliana. Разработка простых методов агробактериальной трансформации с использованием прорастающих семян [34] и генеративных побегов [35, 36] у этого вида позволила значительно увеличить выход трансгенных растений, что и повысило вероятность отбора трансформантов с изменениями в проявлении различных признаков.
Следует отметить, что мутации, индуцированные радиацией или химическими агентами, могут приводить как к небольшим изменениям (замена нескольких нуклеотидов), так и к крупным хромосомным перестройкам. Целостность структуры генов может быть нарушена и внедрением ин-серций экзогенной ДНК при агробактериальном инфицировании тканей растений. С этой точки зрения агробактериальная трансформация может быть рассмотрена как новый источник получения различных мутаций. Так, две мутации у A. thaliana, вызывающие нарушение синтеза хлорофилла, представляли собой аллельные состояния одного и того же гена и были локализованы в одном и том же локусе хромосомы 4 [37]. Одна из них, pale, индуцирована Т-ДНК-инсерцией, вторая, сhlorata, получена при обработке растений химическим мутагеном.
Большим преимуществом мутаций, индуцированных внедрением фрагментов экзогенной ДНК, является то, что инсерция одновременно
может служить маркером геномной локализации генов, функционирование которых было нарушено. Этого преимущества нет в отношении спонтанных мутаций, а также мутаций, полученных при химическом и радиационном мутагенезе. Таким образом, при модификации генома растений с применением методов генной инженерии становится возможным не только придавать растениям новые свойства, но и использовать их для изучения структуры и механизмов функционирования растительного генома.
Данный обзор представляет собой попытку собрать и обобщить обширный экспериментальный материал по тем изменениям, которые могут произойти в геноме растений при интеграции экзогенной ДНК. Основное внимание уделено рассмотрению мутаций у двудольных растений, вызванных природным инсерционным агентом -Т-областью Ti-плазмиды A. tumefaciens. В обзоре мы не рассматриваем спектр мутаций, возникающих в результате внедрения фрагментов экзогенной дНк при прямом переносе.
ИНТЕГРАЦИЯ ЭКОГЕННОЙ Т-ДНК В ГЕНОМ РАСТЕНИЙ
Agrobacterium tumefaciens - почвенная бактерия, наиболее часто обнаруживаемая в области ризосферы растений. Эта бактерия инфицирует двудольные растения и вызывает образование опухолевых структур, получивших название "корончатых галлов". Клетки корончатых галлов обладают способностью к неограниченному росту и синтезу специфических соединений - опи-нов, используемых бактерией в качестве источника углерода, азота и энергии.
В основе процесса заражения растительной клетки лежит перенос части генетического материала агробактерии, называемого Т-областью, или Т-ДНК. Т-ДНК расположена на большой Ti-плазмиде бактерии (от английского tumour-inducing). Инфицирование возможно только при наличии повреждений на растении, так как в этой области образуются вещества фенольной природы и низкомолекулярные сахара, которые необходимы для активации бактериальных генов вирулентности (v/r-генов). Продукты v/r-генов обеспечивают процессинг Т-ДНК и перенос ее в растительную клетку. Вырезание Т-области из плазмиды, перенос и интеграция ее в клетку -сложный и не до конца изученный процесс, в котором принимают участие многочисленные белки как бактерии, так и растения-хозяина.
Гены v/r-области, активированные фенольны-ми соединениями, синтезируемыми при повреждении клеточной стенки, запускают процессинг Т-ДНК по типу конъюгативного бактериального переноса, в результате чего образуются одноце-
почечные молекулы ДНК [38, 39]. Функционирование целого ряда генов в составе мегаплазмиды и хромосомы агробактерии, а также генов инфицированного растения обеспечивает формирование T-комплекса (защищенного белками фрагмента одноцепочечной молекулы ДНК с транспортным белком на одном из концов), образование канала между клетками бактерии и растения и перемещение по нему Т-ДНК-фраг-мента. Сравнительно крупные размеры Т-ком-плекса предполагают существование механизма активного переноса его в растительное ядро, который, в свою очередь, обеспечивается рядом белковых факторов растения-хозяина.
Процесс интеграции многоступенчатый и протекает с участием бактериальных белков и растительных ферментов, отвечающих за репликацию и репарацию ДНК [38, 40-43]. До сих пор не ясно, интегрируется ли Т-ДНК в растительный геном в виде двунитевой или однонитевой молекулы. Существуют противоречивые данные в пользу каждой из гипотез. Так, Де Нив c коллегами считают, что происходит встраивание двунитевой Т-ДНК [44], а рядом исследователей показано встраивание однонитевой молекулы [45-48]. Интеграция происходит при образовании разрывов растительной ДНК [41] по механизму негомологичной рекомбинации [38-40, 45, 46, 49]. После встраивания в растительный геном Т-ДНК становится резидентной частью генома, транскрибируется в растительных клетках РНК-полимеразой II растения-хозяина, и транскрипты имеют особенности эукариотических матриц [50].
При оценке особенностей интеграции Т-ДНК в геном растения возникает вопрос: существуют ли районы предпочтительного встраивания фрагментов экзогенной ДНК ("горячие точки" интеграции) или инсерции чужеродных генов распределены по геному случайно? Анализируя работы по локализации экзогенной ДНК на хромосомах, необходимо подчеркнуть, что авторы не отмечают каких-либо районов предпочтительного встраивания чужеродных генов. Например, у томата Т-ДНК обнаружена в семи различных сайтах пяти хромосом [51], у Crepis capillaris - в трех хромосомах [52]. В случае, когда у растения имеются две или более Т-ДНК-инсерции, они обнаруживаются в разных хромосомах или в различных частях одной и той же хромосомы [53]. Случайное расположение встроек в хромосомах выявлено при картировании 70 Т-ДНК-инсерций у 14 тыс. индивидуально полученных трансформантов A. thaliana, что свидетельствовало об отсутствии "горячих" точек интеграции [54]. Встройки Т-ДНК обнаруживались в интронах, экзонах и нетранслируемых районах.
Использование метода ESTs (expressed sequence tags) для локализации Т-ДНК-встроек в ге-
ном A. thaliana позволило проанализировать около 225 тыс. независимых событий интеграции экзогенной ДНК [55]. При сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей в 88 тыс. районов инсерций Т-ДНК не было обнаружено преимущественного встраивания Т-ДНК в гены какой-либо функциональной группы: встройки маркировали 74% от общего числа генов A. thaliana. С равной вероятностью инсерции происходили в 5'- и 3'-нетранслируемые районы, в области экзонов, интронов и регуляторных элементов [55]. Однако, по мнению авторов, встройки в межгенные районы происходили несколько чаще, чем в области генов. Тенденция встраивания фрагментов экзогенной ДНК в некодирующие районы генома A. thaliana также была отмечена и другими авторами [49, 56, 57]. В исследованиях, проведенных на трансгенных растениях риса, было установлено, что из 3793 случаев инсерции обнаруживались как в районах расположения генов (48.7%), та
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.