БИОХИМИЯ, 2009, том 74, вып. 4, с. 448 - 458
УДК 577.353.2
Т-КАДГЕРИН АКТИВИРУЕТ RAC1 И CDC42 И ВЛИЯЕТ НА ПРОНИЦАЕМОСТЬ ЭНДОТЕЛИЯ***
© 2009 г. Е.В. Семина1, К.А. Рубина2***, П.Н. Руткевич1, Т.А. Войно-Ясенецкая3, Е.В. Парфенова1, В.А. Ткачук2
1 Институт экспериментальной кардиологии, ФГУРКНПК Росмедтехнологий, 121552 Москва,
ул. 3-я Черепковская, 15а; факс: (495)414-6712
2 Факультет фундаментальной медицины МГУ
им. М.В. Ломоносова, 117192 Москва; факс:(495)932-9904, электронная почта: rkseniya@mail.ru
3 Department of Pharmacology, University of Illinois
at Chicago, Chicago, USA; fax: (312)996-1225
Поступила в редакцию 02.10.08 После доработки 20.11.08
В работе изучали сигнальные эффекты Т-кадгерина на модели линейных фибробластов NIH3T3. Было обнаружено, что экспрессия Т-кадгерина активирует Racl и Cdc42 вТРазы (р < 0,01), но не влияет на активность RhoA. Гиперэкспрессия Т-кадгерина с использованием аденовирусных конструкций в клетках HUVEC вызывает разборку микротрубочек и полимеризацию актиновых стресс фибрилл, а подавление экспрессии с использованием лентивирусных конструкций вызывает полимеризацию микротрубочек и уменьшение количества актиновых стресс фибрилл. Подавление экспрессии Т-кадгерина достоверно снижает проницаемость эндотелиального монослоя по сравнению с контролем (р < 0,001).
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Т-кадгерин, Rho вТРазы, проницаемость эндотелиального монослоя, микротрубочки, актин.
Кадгерины — это суперсемейство молекул, обеспечивающих Са2+-зависимую гомофильную межклеточную адгезию. «Классические» кадге-рины имеют внеклеточную часть, с характерной пятидоменной организацией, а также трансмембранную и цитоплазматическую часть, где последняя взаимодействует с компонентами ци-тоскелета и обеспечивает формирование прочных межклеточных контактов [1]. Т-кадгерин — нетипичный представитель суперсемейства кад-геринов. В структуре Т-кадгерина имеется внеклеточная часть, характерная для «классических» кадгеринов [2], но отсутствует трансмембранный и цитоплазматический домены, при этом Т-кадгерин заякорен на мембране через глико-
Принятые сокращения: HUVEC — эндотелиальные клетки пуповины человека, SRE — Serum Response Element, shRNA — короткие шпилечные РНК, GFP — зеленый флуоресцентный белок, siRNA — РНК интерференция, a-GAPDH — глицеральдегидфосфатдегидрогеназа.
* Ускоренная публикация.
** Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 08-186, 15.02.2009.
*** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
зилфосфатидилинозитол [3]. Отсутствие цитоп-лазматической части и локализация Т-кадгери-на в липидных плотах [4] указывает на то, что Т-кадгерин, вероятнее всего, не опосредует формирование стабильных межклеточных контактов, а участвует во внутриклеточной сигнализации [4, 5, 6].
Локализация Т-кадгерина на лидирующем крае мигрирующих эндотелиальных клеток [7], на конусе роста прорастающих к своим мишеням аксонов мотонейронов [8, 9], а также участие Т-кадгерина в прорастании мелких сосудов и капилляров при неоангиогенезе и опухолевом ангиогенезе [10, 11] позволило сделать предположение о том, что Т-кадгерин является навигационным рецептором. В основе механизма, обеспечивающего направленный рост сосудов и нервов, а также миграцию клеток, лежит гомо-фильное связывание между молекулами Т-кад-герина на поверхности мигрирующих клеток, взаимодействующих со своим окружением [3, 10, 12].
В модельных экспериментах in vitro было показано, что взаимодействие между молекулами Т-кадгерина на поверхности эндотелиальных
клеток приводит к активации RhoA- и Rad-сиг-нальных путей, изменению организации акти-нового цитоскелета и смене клеточного фенотипа с нормального на промиграторный [13]. Кроме того, способность эндотелиальных клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин, прикрепляться и распластываться на субстрате, содержащем рекомбинантный Т-кадгерин, достоверно снижается по сравнению с контролем [12]. Однако следует отметить, что в основном, эти данные были получены при изучении влияния Т-кадгерина на клеточную миграцию, пролиферации и адгезию эндотелиальных клеток in vitro.
Результаты, полученные ранее в нашей лаборатории, позволяют предполагать, что Т-кадге-рин участвует не только в процессах роста сосудов de novo и миграции эндотелиальных клеток. В норме Т-кадгерин экспрессируется в мелких и крупных сосудах в эндотелиальных, гладкомы-шечных клетках и перицитах [14], что предполагает важную роль Т-кадгерина в функционировании, в том числе, и зрелых, стабильных сосудов. В настоящей работе, изучая роль Т-кадге-рина в функциональной активности эндотели-альных клеток и изменении клеточного фенотипа при формировании эндотелиального монослоя, мы обнаружили, что экспрессия Т-кад-герина влияет на проницаемость эндотелиаль-ного монослоя, при этом Т-кадгерин участвует в активации внутриклеточной сигнализации с участием LIMK1, Racl и Cdc42 ОТРаз, а изменение экспрессии Т-кадгерина вызывает реорганизацию актинового и микротрубочкового цитоскелета.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали эндотелиальные клетки пуповины человека (HUVEC) 2-го пассажа («СашЬгех»,США) и линейные фиброблас-ты мыши NIH3T3 (ATCC № CRL-1658). Клетки HUVEC культивировали с использованием укомплектованной среды EGM-2 («Cambrex»), для клеток NIH3T3 использовали среду DMEM («Gibco», США) с добавлением пенициллина (0,1 мг/мл), стрептомицина (0,1 мг/мл), и 10% фетальной бычьей сыворотки. Для электрофореза и иммуноблоттинга использовали реагенты фирмы «Bio-Rad Laboratories» (США). В работе использовали первые антитела против Т-кадге-рина («ProSci», США), фосфорилированной ЫМК1-киназы («Cell Signaling Technology», США), c-Myc эпитопа («Santa Cruz Biotechnology», США), а-тубулина («Sigma», США) против RhoA, Rac1 и Cdc42 GTPаз («Santa Cruz Biotechnology», гли-церальдегидфосфатдегидрогеназы (а-GAPDH)
(«Sigma»), а также вторые антитела, конъюгиро-ванные с флуорохромом AlexaFluor594 или AlexaFluor488, и фаллоидин, конъюгированный с AlexaFluor594 («Molecular Probes», Великобритания).
Культивирование и трансфекция эукариоти-ческих клеток. Клетки высевали на культураль-ные флаконы из расчета 104 клеток/см2 и культивировали в СО2 инкубаторе при 37°. Для гиперэкспрессии Т-кадгерина в NIH3T3 клетках использовали плазмиду, содержавшую кДНК Т-кадгерина (pcDNA3.1/T-cad), созданную ранее в нашей лаборатории [15], или контрольную плазмиду pcDNA3.1 («Invitrogen», США). В эксперименте по измерению активности SRE (Serum Response Element) клетки NIH3T3 транс-фицировали плазмидами pcDNA3.1/T-cad, pcDNA3.1, плазмидой для экспрессии ß-галак-тозидазы pCMV-b-Gal («Clontech», США), плазмидой для экспрессии люциферазы и SRE-SRE.L («Stratagene», США). В качестве положительного контроля при измерении активации SRE использовали плазмиду, содержавшую ген p114RhoGEF, который является фактором обмена гуанидина и активирует Rho GTPaзы. Для подавления активности Rho GTPaз использовали плазмиды, несущие доминантно-негативные конструкты RhoN17, RacN17 и Cdc42N19 для RhoA, Rac1 и Cdc42 соответственно. При оценке активации Rho GTPaз методом осаждения с использованием Сефарозы («pull-down assay») клетки NIH3T3 трансфицировали плазмидами, несущими гены постоянно активных форм GTPaз: для RhoA - RhoV12, для Rac1 - RacV12, для Cdc42 — Cdc42V12. Для оценки влияния гиперэкспрессии Т-кадгерина на активацию LIMK1 клетки NIH3T3 котрансфицировали плазмидами pcDNA3.1/T-cad и плазмидой myc-LIMK1, кодирующей LIMK1 и c-myc-эпитоп для усиления эндогенной экспрессии LIMK1 и для контроля присутствия трансгена в трансфи-цированных клетках; контрольные клетки кот-рансфицировали плазмидами pcDNA3.1 и myc-LIMK1. Клетки NIH3T3 трансфицировали с использованием реагента Lipofectamine2000TM («Invitrogen») согласно инструкции производителя. Для оценки влияния гиперэкспрессии Т-кад-герина на организацию микротрубочек, HUVEC котрансфицировали плазмидой pcDNA3.1/T-cad и плазмидой, содержавшей ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) для визуализации трансфицированных клеток (pcDNA3.1/GFP); в контроле клетки трансфицировали плазмидами pcDNA3.1 и pcDNA3.1/GFP. Для подавления экспрессии Т-кадгерина методом РНК-интерференции (siRNA), эндотелиальные клетки ко-трансфицировали малыми интерферирующими
РНК («Dharmacon», США) (siRNA/T-cad) и плазмидой pcDNA3.1/GFP для визуализации трансфицированных клеток; в качестве контроля использовали плазмиду pcDNA3.1/GFP. Для трансфекции эндотелиальных клеток использовали реагент CytoPure-hwv («Qbiogen», США) согласно инструкциям производителя. Уровень экспрессии Т-кадгерина, RhoA, Racl, Cdc42, LIMK1, c-Myc, a-GAPDH, ß-катенина и VE-кадгерина оценивали методом иммуноблоттин-га с использованием клеточных лизатов, как было описано ранее в [6].
Метод измерения проницаемости эндотелиального монослоя in vitro. Для оценки проницаемости эндотелия использовали метод, описанный ранее в [16]. Клетки HUVEC 2-го пассажа высаживали в верхнюю камеру на полупроницаемую мембрану ячеек трансвелл («Transwell®», «Corning», США) с размером пор 0,4 мкм и радиусом мембраны 6,5 мм в количестве 105 клеток/лунку. Через 72 ч, после достижения клетками монослоя, в верхнюю камеру ячеек транс-велл вносили раствор декстрана, конъюгиро-ванного с флуоресцентным красителем FITC (FITC-dextran, «Sigma»), в конечной концентрации FITC-декстрана 10 мкг/мл. Через 60 мин из нижней камеры отбирали 20 мкл аликвоты и измеряли интенсивность флуоресценции FITC при длине волны 525 нм. Далее для последующих измерений пробы отбирали каждые 60 мин. Эксперимент проводили в четырех параллелях и повторяли 5 раз. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего, р < 0,001.
Иммунофлуоресцентное окрашивание эндотелиальных клеток. Клетки HUVEC 2-го пассажа культивировали до образования монослоя в планшете CultureSlide™ («Beckton Dikinson», США) и переводили на бессывороточную среду EGM-2 за 4 ч до начала эксперимента. При окрашивании HUVEC антителами к a-тубулину проводили дополнительную инкубацию в растворе 2 мкМ таксола для стабилизации микротрубочек
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.