МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 79, № 5, с. 688-695
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.8:582.26(282.256.341)
ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С КУЛЬТИВИРУЕМОЙ ДИАТОМЕЕЙ SYNEDRA
ACUS ИЗ ОЗЕРА БАЙКАЛ
© 2010 г. Ю. Р. Захарова, Р. В. Адельшин, В. В. Парфенова, Е. Д. Бедошвили, Е. В. Лихошвай
Лимнологический институт СО РАН, Иркутск Поступила в редакцию 08.10.2010 г.
Таксономическое определение микроорганизмов, ассоциированных с диатомовыми водорослями, проводили комплексом методов микроскопии, микробиологии и филогенетического анализа. При культивировании на байкальской воде пресноводной диатомеи Synedra acus методами эпифлуоресцентной и электронной микроскопии показано, что бактерии колонизируют слизь, скрепляющую клетки живых микроводорослей, поверхность клеток, проникают внутрь панцирей погибших диатомей. Изолировано в чистую культуру и охарактеризовано 13 штаммов гетеротрофных бактерий. По результатам исследований морфологических, физиолого-биохимических признаков и анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изолированные штаммы определены до вида или рода — Sphingomonas sp., Vario-voraxparadoxus, Pseudomonas fluorescens, Microbacterium trichotecenolyticum, Rhodococcus sp., Caulobacter vibrioides, Brevundimonas vesicularis.
Ключевые слова: микроорганизмы, диатомовые водоросли, озеро Байкал, 16S рРНК, эпифлуоресцентная, сканирующая и трансмиссионная электронная микроскопия.
Бактерии и диатомеи сосуществуют в водной среде, их взаимодействие может иметь различный характер. Основная часть опубликованных работ представлена результатами исследований морских экосистем. Показана зависимость диатомей от бактериальных метаболитов, например, витаминов [1, 2]. Бактерии, в свою очередь, зависимы от метаболитов, выделяемых диатомеями [3—5]. При культивировании выявлено, что микроорганизмы могут быть различными у диатомей, даже если они взяты из одного источника. Исследователями также описана сукцессия бактериальных морфотипов эпифитных бактерий, присоединенных к поверхности клеток диатомей, при переходе от активной фазы роста микроводорослей к стационарной [4]. Один из аспектов исследований последних десяти лет, который представляет большой научный интерес, — это определение роли бактерий в деструкции диатомей во время их осаждения и диагенеза [6].
Вопросы участия микроорганизмов в круговороте кремния в мировом океане исследованы и опубликованы в нескольких работах. Показано, что скорость растворения кремнезема морских диатомей in situ значительно увеличивается под воздействием природных морских бактерий [7—9], представляющих специфические филотипы: a-Proteobacteria, р-Proteobacteria, y-Proteobacteria, Cytophaga-Flavobacter-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: zakharova@ lin.irk.ru).
im—Bacteroides (CFB) группы, Actinobacteria, Bacillus [10-12].
Работ по взаимодействию микроорганизмов и пресноводных диатомовых водорослей существенно меньше. Выявлены основные бактериальные спутники (Proteobacteria и Bacteroidetes) в диатомовых матах и культурах диатомей из пресноводных сред обитания [13]. Известно также, что у-протеобактерия Pseudomonas putida обладает антагонистической активностью по отношению к пресноводной диатомовой водоросли Stephanodiscus hantzschii [14].
Пресноводная диатомея Synedra acus subsp. radians (Kütz.) Skabitsch. стала одним из объектов исследований, направленных на расшифровку механизмов транспорта кремниевой кислоты внутрь клетки и биоминерализации кремнезема [15-17], понимание которых представляет большой интерес для развития биотехнологий. Ранее был отработан метод культивирования диатомовой водоросли Synedra acus в больших емкостях, что позволяет получать биомассу в существенном количестве (десятков граммов в неделю в 100-литровом фотобиореакто-ре). Использование биомассы направлено на получение биогенного кремнезема, ДНК, белков и липи-дов, в том числе эйкозапентаеновой кислоты [18]. В процессе культивирования диатомей замечена сопутствующая микрофлора, а в отдельных экспериментах происходил процесс замедления роста водоросли и впоследствии ее гибель.
Целью исследования было определение таксономического состава и характеристика физиолого-биохимических свойств бактерий, ассоциированных с байкальской пресноводной диатомеей Synedra acus при ее культивировании.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение и культивирование. Культура диатомовой микроводоросли Synedra acus subsp. radians была изолирована из природной популяции в районе залива Лиственичный озера Байкал. Культуру водоросли выращивали в 100-литровом фотобио-реакторе, как описано ранее [18] на среде DM1 следующего состава, мг/л: Ca(NO3)2 • 4H2O — 20; KH2PO4 - 12.4; MgSO4 • 7H2O - 25; NaHCO3 - 16; №2ЭДТА - 2.25; H3BO3 - 2.48; MnCl2 • 4H2O - 1.39; (NH4)6Mo7O24 • 4H2O - 1; цианкобаламин (витамин В12) - 0.04; тиамин гидрохлорид (витамин В1) - 0.04; биотин - 0.04; Na2SiO3 • 5H2O -57 [19].
Микроорганизмы из альгобактериальной культуры выращивали в аэробных условиях на чашках Петри с рыбо-пептонным агаром, разбавленным в десять раз (РПА/10) и на оригинальной среде с экстрактом водоросли (ДА). Для получения ДА диатомовые водоросли S. acus концентрировали на фильтре, 1 г полученной биомассы суспендировали в 100 мл воды и нагревали до кипения, добавляли 1.5 г агара. Проводили посев исходной альгобактериаль-ной культуры в стерильно приготовленную среду. Бактериальные культуры выращивали аэробно при 25°С на чашках Петри, чистые культуры бактерий выделяли на среде того же состава методом истощающего штриха.
Изучение физиолого-биохимических свойств бактерий проводили стандартными методами [20, 21].
Концентрацию клеток микроводорослей и общую численность бактерий, колонизирующих S. acus, определяли методом эпифлуоресцентной микроскопии после окрашивания флуорохромным красителем ДАФИ (4,6-диамино-2-фенилиндол) при концентрации 0.5 мкг/мл, определенный объем осаждали на фильтры "Nuclepore" (РС) с диаметром пор 0.2 мкм и анализировали в эпифлуоресцентном микроскопе ("Olympus", Япония). Подсчет клеток осуществляли с помощью программного комплекса, разработанного НТИ ЛИН СО РАН (авт. свидетельство № 2005610667).
Изучение морфологических признаков штаммов микроорганизмов проводили с помощью световой микроскопии, сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) ("Philips SEM 525M", Голландия) и трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) ("Leo 906Е ZEISS", Германия). Идентификацию до вида производили по определителям бактерий [22, 23].
Выделение ДНК и проведение ПЦР. Для выделения ДНК из чистых культур бактерий использовали лизоцим, 10% SDS, фенол-хлороформенную экстракцию. ДНК амплифицировали в ПЦР (набор "Амплисенс", Москва) с универсальными прайме-рами для гена 16S рРНК эубактерий: 500L: 5'-CGT-GCCAGCAGCCGCGGTAA-3' и 1350R: 5'-GACGGGCGGTGTGTACAAG-3' при следующих условиях: 94°С - 1 мин; 94°С - 20 с; 50°С - 20 с; 72°С - 30 с; - 30 циклов; 72°С - 5 мин.
Определение нуклеотидных последовательностей и филогенетический анализ. Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе CEQ8800 ("Beckman Coulter", США) c набором реактивов GenomeLab DTCS - Quick Start Kit ("Beckman Coulter", США) и праймерами, указанными выше. Расшифрованные в данной работе нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК длиной 570 п.н. опубликованы в GenBank под номерами с EU671061 по EU671073. Анализ нуклеотид-ных последовательностей исследуемых штаммов проводили с помощью программы BioEdit 5.0.9, для филогенетического анализа использовали программу MEGA 3.1.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В условиях культивирования лабораторной культуры S. acus отмечено угнетение развития и последующая гибель клеток. Микроскопический анализ проб после окрашивания ДАФИ выявил сопутствующую микрофлору, колонизирующую клетки диа-томей. Численности бактерий в течение эксперимента увеличивалась от 1.2 х 105 до 5.4 х 106 (рис. 1).
В течение первых шести суток наблюдали увеличение численности как бактериальной популяции, так и S. acus. Микроскопический анализ показал, что в первые дни культивирования бактерии локализованы в слизи, скрепляющей живые клетки диа-томей, в которых хорошо видны хлоропласты и ядра (рис. 2а, 2б). В стационарной фазе роста микроводорослей (6-9 сут) наблюдался экспоненциальный рост бактерий, которые активно колонизировали поверхность клеток S. acus (рис. 2в, 2г). В последующем (12-14 сут), когда концентрация клеток S. acus резко падает, а бактерий продолжает увеличиваться, видно, что они не только активно колонизируют поверхность клеток водоросли (рис. 2в, 2г), но также проникают внутрь погибших клеток (рис. 2д) и локализуются на панцирях разрушенных клеток водорослей (рис. 2е).
Из альгобактериальной культуры в стадии угнетения развития S. acus на твердых питательных средах выделено и охарактеризовано 13 штаммов, отличающихся по морфологическим признакам (рис. 3, 4) и биохимическим свойствам (таблица). Штаммы baik7s, baik8s, baik14s, baik16s, baik21s baik22s, baik25s и baik26s были выделены на среде РПА/10; штаммы
Сутки
Рис. 1. Динамика роста диатомовой водоросли Synedra acus и сопутствующих бактерий при ее культивировании: 1 — общее число бактерий; 2 — численность S. acus.
Ъа1к178, Ъа1к208, Ъа1к278, Ъа1к288, Ъа1к378 выделены на ДА при температуре инкубирования 25—28°С и рН 6.8—7.0. Показано, что на филогенетическом дереве выделенные штаммы группировались в три кластера, при этом штаммы, выделенные на ДА, группировались отдельно (рис. 5).
Штамм Ъа1к78 по морфо-биохимическим признакам отнесен к роду Sphingomonas. Клетки бактерий палочковидной формы (0.4—0.5 х 0.8—1.0 мкм) (рис. 3а), грамотрицательные. По данным анализа нуклеотидных последовательностей гена 168 рРНК из всех известных структур базы данных GenBank максимальное сходство (92%) к последовательности
штамма baik7s имеет штамм Novosphingobium subter-raneum (Sphingomonas subterranea), изолированный из морских осадков (рис. 5).
Штамм baik8s — прямые или слегка изогнутые палочки (0.4—0.5 х 1.2—1.5 мкм), расположены парами или по одной (рис. 4а), грамотрицательные. По
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.