МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 76, № 2, с. 253-262
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК: 579.57.063.639.4
ТАКСОНОМИЧЕСКИЙ СОСТАВ МИКРОФЛОРЫ, АССОЦИИРОВАННОЙ С КУЛЬТИВИРУЕМЫМИ МОЛЛЮСКАМИ CRASSOSTREA LUGUBRIS И PERNA VIRIDIS И С ВОДОЙ В ЛАГУНЕ
ЗАЛИВА НЯЧАНГ, ВЬЕТНАМ
© 2007 г. И. А. Беленева*' 1, Н. В. Жукова*, X. Ле Лан**, Д. X. Нгуен Тран**
*Институт биологии моря ДВО РАН, Владивосток ** Institute of Oceanography 01 Cau Da, Nha Trang, Vietnam Поступила в редакцию 24.05.2006 г.
Из двух видов двустворчатых моллюсков, культивируемых в заливе Нячанг (Вьетнам), и проб воды марикультурного хозяйства выделено и охарактеризовано 104 штамма гетеротрофных бактерий. Идентификация изолятов проведена по совокупности морфологических, физиолого-биохимиче-ских и хемотаксономических характеристик, а также по содержанию Г+Ц в ДНК. В составе микрофлоры моллюсков преобладали вибрионы Vibrio alginolyticus, а также обнаружены патогенные виды V. harveyi и V. splendidus. Второе место по численности после вибрионов занимали стафилококки и бациллы. Кроме того, выявлены коринеформные и энтеробактерии, а также Pseudomonas spp. и Pseudoalteromonas spp. Состав микрофлоры воды отличался более высоким видовым разнообразием по сравнению с микрофлорой моллюсков. Преобладающими в воде были бактерии Bacillus spp., Vibrio spp., Pseudomonas spp. В значительном количестве встречались Brevibacterium spp. и другие коринеформные бактерии и энтеробактерии. Помимо них отмечены Pseudoalteromonas spp., Marino-coccus sp., Halobacillus sp., Shewanella sp., Sulfitobacter sp. и бактерии CFB-кластера. Обнаруженные патогенные и условно патогенные виды бактерий в воде и моллюсках, по-видимому, являются причиной высокой смертности культивируемых животных в марикультурном хозяйстве.
Ключевые слова: бактериальные сообщества, жирные кислоты, моллюски, марикультура.
Во всем мире стремительно возрастает роль культивируемых гидробионтов как источника ценного и относительно дешевого белка. Двустворчатые моллюски, в том числе мидии и устрицы, являясь фильтраторами, прокачивают через свой организм огромные количества воды, до 7.5 л/ч [1], для обеспечения организма достаточным количеством пищи и кислорода. Культивируемые организмы трансформируют среду своего обитания, изменяя состав биоты и субстрата [2]. Они высвобождают в водную толщу массу питательных веществ и накапливают связанные с плотными частицами поллютанты. Искусственно выращиваемые беспозвоночные животные могут аккумулировать опасные для человека и гидробионтов бактериальные патогены, являясь резервуаром вибрионов [3]. Многие виды вибрионов, обитающих в морской среде, являясь патогенными как для человека, так и для морских животных, наносят хозяйствам марикультуры огромный экономический ущерб [4]. Вследствие этого проведение бактериального мониторинга в хозяйствах марикультуры является чрезвычайно необходимым и обоснованным.
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: beleneva.vl@mail.ru).
Целью настоящей работы было определение состава гетеротрофной микрофлоры, ассоциированной с культивируемыми моллюсками - устрицей Crassostrea lugubris и зеленой мидией Perna viridis, а также микрофлоры окружающей воды и выявление возможных патогенов беспозвоночных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Пробы животных и воды отбирали в январе 2005 г. в лагуне марикультурного хозяйства залива Нячанг (Вьетнам). Отбор проб производили на четырех станциях, имеющих следующие характеристики:
Станция 1. Центральная часть лагуны, не используемая под марикультуру. Глубина 4 м.
Станция 2. Расстояние по прямой от берега 70 м. Глубина 0.6-0.8 м. Садки с устрицами расположены по всей глубине водной толщи.
Станция 3. Расстояние от берега 150 м. Глубина 2 м. Садки с устрицами и мидиями располагались на глубине 0.5-1.0 м.
^анция 4. Расстояние от берега 1000 м. Глубина 2 м. Садки с мидиями располагались на глубине 0.5-1.0 м.
Животных, отобранных на станциях 2-4, клали в стерильные пластиковые пакеты. Образцы воды, взятые батометром с поверхности и у дна на каждой станции, за исключением станция 2, где глубина не достигала 1 м, помещали в стерильные пробирки. Образцы транспортировали до лаборатории на льду. Животных вскрывали, мягкие ткани взвешивали и ткани общей пробы из 10 животных растирали в ступке до гомогенного состояния, соблюдая условия асептики.
Для посева на бактериальные среды гомогенат мягких тканей разводили 100-кратно стерильной морской водой. На TCBS-агар, Эндо-агар, среду Чапмена засевали по 0.1 и 1 мл на чашку этого го-могената, на среду Youschimizu-Kimura (Y-K) [5] -по 0.1 мл гомогената серийных разведений. Численность гетеротрофных бактерий определяли на среде Y-K засевом 0.1 мл неразведенной морской воды и серийных разведений каждого образца, а также гомогената моллюсков. Чашки с посевами на трех вышеназванных средах держали двое суток при 35°С, на среде Y-K - до двух недель при комнатной температуре. Ежедневно чашки просматривали, подсчитывали число выросших колоний и отсевали уколом колонии всех морфотипов на новые чашки с соответствующей средой для последующих пересевов с целью получения чистой культуры бактериального изолята.
Морфологию колоний выделенных культур изучали на среде выделения, РПА и среде Y-K с использованием стереомикроскопа МБС-10. Подвижность бактерий в культурах исследовали в живом состоянии с применением темнопольного конденсора. Морфологию клеток и тип клеточных стенок изучали в окрашенных по Граму препаратах.
При изучении свойств выделенных штаммов определяли наличие лизин-, орнитиндекарбоксилаз и аргининдигидролазы как по Моллеру, так и с использованием СИБ (система индикаторная бумажная) для идентификации вибрионов, и СИБ для идентификации бактерий семейства Enterobacteri-aceae. Проверяли образование индола, ацетилме-тилкарбинола, окисление и ферментацию глюкозы по Хью-Лейфсону, реакцию с цитратом Симмонса, восстановление нитратов, наличие каталазы и ци-тохромоксидазы. Способность расщеплять с образованием кислоты лактозу, сахарозу, арабинозу, маннозу, маннит, инозит исследовали как на средах Гисса, так и с использованием СИБ. Способность продуцировать желатиназу и амилазу определяли на агаре, содержащем соответствующий субстрат. Резистентность к ампициллину, полимиксину, окси-циллину, стрептомицину, бензилпенициллину и вибриостатическому агенту 0-129 определяли методом диффузии в агар с помощью бумажных дис-
ков, пропитанных соответствующим антибиотиком. Потребность культур в ионах Na+ проверяли на среде без NaCl и среде, содержащей 3, 6, 8, 10, 12.5, 15, 20% NaCl соответственно. Выделение ДНК из клеток и определение содержания Г+Ц в ДНК проводили согласно методам, примененным нами ранее [6]. Идентификацию выделенных изо-лятов проводили по совокупности перечисленных выше признаков с использованием руководства [7] и ключей для идентификации вибрионов [8]. Штаммы выделенных культур сохраняли в пробирках с 20% глицерина в морской воде при -75°С. На основании проведенного исследования морфологических, культуральных, некоторых биохимических свойств все бактериальные изоляты разнесли по группам так, что в каждой отдельной группе оказались штаммы с идентичным набором фенотипических признаков. Из каждой группы изолятов случайным образом отобрали по 1 штамму для проведения анализа жирных кислот бактерий согласно ранее применявшимся нами методам [9]. Видовую принадлежность некоторых штаммов определяли секвенированием 16S рРНК бактериальных изолятов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Из проб культивируемых моллюсков и воды выделено в чистые культуры и охарактеризовано 104 изолята гетеротрофных бактерий (42 и 62 штамма соответственно). Два изолята к настоящему времени не идентифицированы. При идентификации бактериальных изолятов учитывали их морфологические, культуральные, биохимические и хемотаксономические свойства. Вибрионы, бациллы, флавобактерии, псевдомонады, стафилококки, бактерии группы кишечной палочки идентифицировали по совокупности признаков, описанных нами ранее в работе, посвященной характеристике микрофлоры, ассоциированной с кораллами из залива Нячанг [9]. Так как оба исследования были проведены в одном районе и состав микрофлоры изученных объектов по ряду таксонов был идентичен, мы сочли возможным в настоящей работе привести характеристику свойств только тех бактерий, которые ранее не были нами изолированы из гидробионтов и воды залива Нячанг.
Вследствие того, что среди вибрионов есть как патогенные, так и непатогенные виды, идентификация бактерий рода Vibrio до вида в нашем исследовании имела особенно важное значение. Поэтому данные о фенотипических свойствах вибрионов приведены в отдельной таблице. Для выделения всего видового спектра вибрионов нами использовался тиосульфат-цитрат-сахарозный агар с желчью (TCBS-агар). TCBS-агар недооценивает плотность популяции вибрионов по сравнению с морским агаром (МА), но позволяет обнаружить минорные виды Vibrio [10]. Бактерии V. alginolyticus
Таблица 1. Фенотипические свойства некоторых штаммов Vibrio spp.
Тест Виды вибрионов
V. alginolyticus V. parahaemolyticus V. vulnificus V. splendidus V. harveyi
Оксидаза + + + + +
O/F тест +/+ +/+ +/+ +/+
Подвижность + + + + +
Аргининдигидролаза - - - - -
Лизидекарбоксилаза + + + _ +
Орнитиндекарбоксилаза у** у + _ +
Кислота из:
лактозы - - - - -
сахарозы + - - - +
арабинозы - - - - -
маннозы + + + + +
маннита + у - + +
инозита - - - - -
Индол + + + + +
Нитрат редуктаза + + + + +
Рост на NaCl, % 0 6
+ + + + +
8 + + - - -
10 + - - - -
Амилаза + + + + +
Желатиназа + + + + +
Чувствительность к
0-129 + + + + +
ампициллину - - - - -
полимиксину + + + + +
Содержание Г+Ц в ДНК, мол. % 45.2-45.6 47.0-47.9 46.3 45.8 48.8
*"+/+" - окисление/брожение глюкозы на среде Хью-Лейфсена. ** Признак вариабельный в зависимости от штамма.
характеризовались отсутствием аргининдигидрола-зы, способностью образовывать кислоту из сахарозы, маннозы, маннита, отсутствием роста без Na+ и ростом на средах с содержанием NaCl до 10% (табл. 1). Содержание Г+Ц оснований в ДНК этого вида варьировало незначительно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.