МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 3, с. 355-370
= ОБЗОРЫ :
УДК 577.21
TALE-НУКЛЕАЗЫ - НОВЫЙ ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА © 2014 г. Д. В. Глазкова*, Г. А. Шипулин
Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, 111123
Поступила в редакцию 07.11.2013 г.
Принята к печати 23.12.2013 г.
Внесение целенаправленных изменений в геном живых клеток или целых организмов позволяет решать множество задач фундаментальной науки, биотехнологии и медицины. "Выключение" генов-мишеней в зиготах дает возможность изучать функции этих генов у различных организмов, а замена отдельных нуклеотидов в ДНК — исправлять мутации в генах и таким образом лечить наследственные заболевания. Введение гена в нужную область генома можно использовать для получения клеток-продуцентов или организмов с определенными свойствами. Подобные манипуляции с геномами стали возможными после появления технологии, получившей название "редактирование генома". Эта технология основана на внесении разрыва в определенный участок хромосомной ДНК с помощью эндонуклеазы, распознающей уникальные последовательности, и последующего восстановления целостности ДНК за счет клеточных механизмов репарации. Для редактирования генома необходимы эндонуклеазы с изменяемой специфичностью, способные избирательно расщеплять выбранную последовательность-мишень. Появление нового типа программируемых эндонуклеаз, сконструированных на базе бактериальных белков — TAL-эффекто-ров (Transcription Activators Like Effector, TALE), стало важным этапом в развитии технологии редактирования и способствовало широкому распространению ее методов. В настоящем обзоре рассмотрена история открытия TAL-эффекторов и создания TALE-нуклеаз, описаны их преимущества перед полученными ранее эндонуклеазами с цинковыми пальцами. Отдельный большой раздел посвящен описанию генетических модификаций, которые можно осуществлять, используя разные способы редактирования генома.
Ключевые слова: редактирование генома, ТАЪЕ-нуклеазы, нуклеазы с цинковыми пальцами, гомологичная рекомбинация, негомологичное соединение концов ДНК.
TALE NUCLEASES - NEW TOOL FOR GENOME EDITING, by D. V. Glazkova*, G. A. Shipulin (Central Research Institute for Epidemiology, Moscow, 111123 Russia; *e-mail: glazkova@pcr.ru). The ability to introduce targeted changes in the genome of living cells or entire organisms enables researchers to meet the challenges of basic life sciences, biotechnology and medicine. Knockdown of target genes in the zygotes gives the opportunity to investigate the functions of these genes in different organisms. Replacement of single nucleotide in the DNA sequence allows to correct mutations in genes and thus to cure hereditary diseases. Adding transgene to specific genomic loci can be used in biotechnology for generation of organisms with certain properties or cell lines for biopharmaceutical production. Such manipulations of gene sequences in their natural chromosomal context became possible after the emergence of the technology called "genome editing". This technology is based on the induction of a double-strand break in a specific genomic target DNA using endonucleases that recognize the unique sequences in the genome and on subsequent recovery of DNA integrity through the use of cellular repair mechanisms. A necessary tool for the genome editing is a custom-designed endonuclease which is able to recognize selected sequences. The emergence of a new type of programmable endonucleases, which were constructed on the basis of bacterial proteins — TAL-effectors (Transcription activators like effector), has become an important stage in the development of technology and promoted wide spread of the genome editing. This article reviews the history of the discovery of TAL effectors and creation of TALE nucleases, and describes their advantages over zinc finger endonucleases that appeared earlier. A large section is devoted to description of genetic modifications that can be performed using the genome editing
Keywords: gene editing, TALE nuclease, zinc finger nuclease, homologous recombination, non-homologous end joining.
DOI: 10.7868/S0026898414030057
Принятые сокращения: TALE — TAL-эффекторы, эффекторы, похожие на активаторы транскрипции; ZF-нуклеазы — нуклеазы с цинковыми пальцами.
* Эл. почта: glazkova@pcr.ru
ВВЕДЕНИЕ
Возможность получать клетки или организмы, в которых целенаправленно изменены отдельные гены или другие элементы генома, позволяет решать многие задачи фундаментальной науки, биотехнологии и медицины. В 2007 г. Нобелевской премией было отмечено "открытие принципов введения специфических генных модификаций в организм мышей посредством эмбриональных стволовых клеток". Результатом этого открытия стал метод получения мышей с избирательно инактивированными (нокаутными) генами. Этот метод открыл новую страницу в генетике млекопитающих и стал мощным инструментом в изучении функций генов, однако подобные исследования долгое время были ограничены только одним видом животных — мышами. Возможность манипулировать с геномом мышей, но не других организмов, стала одной из причин того, что именно мышей наиболее часто используют для моделирования наследственных болезней человека.
В настоящее время активно разрабатываются методы генной терапии наследственных заболеваний человека. В первых клинических испытаниях в одну из хромосом добавляли исправную копию дефектного гена, которую встраивали произвольным образом с помощью вирусных векторов. Недостаток такой стратегии состоит в том, что, с одной стороны, введенная экзогенная ДНК может нарушать работу окружающих генов, что вызовет тяжелые побочные эффекты. С другой стороны, попадание гена в неактивный участок хромосомы ослабляет его экспрессию и приводит к неэффективности терапии. Идеальное решение такой задачи — коррекция гена, т.е. внесение необходимых исправлений непосредственно в область мутантно-го гена, в этом случае сохраняется физиологическая регуляция его экспрессии с помощью эндогенного промотора.
Модификация генов в любых организмах или клетках, создание различных модельных животных, коррекция генов при наследственных заболеваниях — эти и многие другие возможности открывает технология, получившая название редактирование генома. В ее основе лежит внесение разрыва в определенный участок геномной ДНК, репарация которого с помощью клеточных механизмов гомологичной или негомологичной рекомбинации приводит к желаемым перестройкам. Последние научные достижения делают метод все более эффективным и доступным, что открывает новые перспективы его применения в биотехнологии для создания организмов с заданными свойствами и в медицине — в генотерапии наследственных заболеваний. Одно из таких достижений — создание ТЛЬБ-нуклеаз, которым посвящена наша статья.
ВОЗНИКНОВЕНИЕ ТЕХНОЛОГИИ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА И ЕЕ РАЗВИТИЕ
Впервые возможность внесения направленных изменений в геном эукариот была показана на клетках дрожжей [1]. Примененный с этой целью метод был основан на гомологичной рекомбинации между эндогенным локусом-мишенью и введенным экзогенным фрагментом ДНК. В конце 80-х данный способ успешно адаптировали для клеток млекопитающих [2, 3], и до сегодняшнего дня он используется при конструировании перевиваемых клеточных линий или для получения "нокаутных" животных [4]. Главное ограничение этого метода — низкая частота естественных ре-комбинационных событий: в лучшем случае желаемая модификация возникает лишь в 1 из 105 клеток, получивших экзогенную ДНК [5], что делает его неприемлемым для работы с большинством первичных клеточных линий или с целыми организмами.
Дальнейшее развитие технологии стало возможным после того как, во-первых, было обнаружено, что образование двухцепочечного разрыва в ДНК в несколько тысяч раз увеличивает вероятность рекомбинации [6, 7], а, во-вторых, были открыты мегануклеазы — ферменты, распознающие и расщепляющие ДНК протяженностью более 14 п.н. Столь высокая избирательность нуклеаз позволяет вносить двухцепочечные разрывы в уникальный участок хромосомы, который далее подвергается модификации в процессе репарации. Чтобы метод стал универсальным, необходимо было сконструировать нуклеазы, специфичность которых можно изменять в соответствии с нуклеотид-ной последовательностью мишени. До недавнего времени работы велись в двух направлениях: перепрограммирование так называемых хоуминг-эндо-нуклеаз, которые кодируются мобильными элементами и встречаются во многих микроорганизмах [8], и конструирование искусственных нуклеаз с цинковыми пальцами (Zink Finger nuclease, ZF-нукле-аза) [9].
Наибольшее число хоуминг-эндоуклеаз с различной специфичностью создано на базе эндо-нуклеазы I-CreI, кодируемой хлоропластной ДНК сине-зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii, способной селективно расщеплять последовательности длиной 19—24 п.н. [10]. Путем направленного изменения аминокислотных остатков I-CreI, участвующих во взаимодействии с ДНК, получили коллекцию, включающую несколько сотен вариантов нуклеаз, распознающих новые нуклеотидные последовательности [8, 11]. Возможность комбинировать субдомены различных белков полученной библиотеки позволила еще более расширить число потенциальных сайтов распознавания [11, 12]. Удалось отобрать нуклеазы, избирательно рас-
щепляющие два гена человека — XPC и RAG1 [11, 12], а также уникальную последовательность в геноме кукурузы [13]. Однако несмотря на значительный прогресс, достигнутый в области перепрограммирования I-CreI, процесс конструирования нуклеаз с заданной специфичностью остается трудоемким, а выбор мишеней весьма ограниченным.
При конструировании ZF-нуклеаз объединили домен c неспецифической нуклеазной активностью и ДНК-связывающий домен [9]. Нуклеаз-ный домен заимствовали из рестриктазы FokI, относящейся к ферментам рестрикции типа IIS. В качестве ДНК-связывающего домена использовали белковый домен, включающий несколько так называемых цинковых пальцев Cys2-His2 (ZF-домен), который входит в состав многих факторов транскрипции эукариот и является вт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.