ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 462, № 4, с. 484-487
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.15.08
ТЕЛОМЕРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ В МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТКАХ
ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ КАК УНИВЕРСАЛЬНАЯ ШКАЛА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ АКТИВАЦИИ ТЕЛОМЕРАЗЫ НА ПРИМЕРЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПЕЧЕНИ
© 2015 г. Д. А. Скворцов, М. А. Ежова, Ю. Э. Лурье, А. В. Метелин, И. Д. Стражеско, Е. Н. Дудинская, М. А. Калинина, М. Э. Зверева, член-корреспондент РАН О. А. Донцова, Э. Ф. Ким
Поступило 11.12.2014 г.
БО1: 10.7868/80869565215160264
Оценка прогноза развития заболевания, в частности, первичных опухолей печени (наиболее часто встречаются гепатобластома и гепато-клеточная карцинома, ГКК) имеет высокую значимость.
Для ГКК, наряду с хорошо известными маркёрами — альфа-фетопротеином и гамма-карбокси-протромбином — одним из независимых маркёров канцерогенеза, найденным в широкомасштабном исследовании, является повышенная активность теломеразы [1].
Теломераза — это рибонуклеопротеиновый комплекс, состоящий из теломеразной РНК, белка те-ломеразной обратной транскриптазы (ТБЯТ) и ряда ассоциированных белков. ТБЯТ синтезирует по матричному участку теломеразной РНК повторяющиеся последовательности ДНК на концах хромосом [2]. Количество таких повторов (длина теломер) согласуется с возможным количеством клеточных делений и определяет проли-феративный потенциал клетки [2].
Активность теломеразы не проявляется в соматических клетках и тканях человека за редким исключением [3, 4]. Активация теломеразы в опухолевых клетках наблюдается примерно в 85%
Московский государственный университет
им. М.В. Ломоносова
E-mail: skvorratd@mail.ru
Российский научный центр хирургии
им. Б.В. Петровского
Российской Академии наук, Москва
Государственный научно-исследовательский центр
профилактической медицины
Министерства здравоохранения
Российской Федерации, Москва
Сколковский институт науки и технологий,
Московская обл.
случаев. В соматических клетках с активной тело-меразой уровень её активности ниже, чем в раковых [5]. Наличие теломеразной активности характерно именно для злокачественных опухолей, в то время как в доброкачественных опухолях активность этого фермента либо не выявляется вовсе, либо частота ее обнаружения низка [5—7]. Показано наличие теломеразной активности в некоторых клетках крови, в эмбриональных, репродуктивных клетках и клетках некоторых быстро обновляющихся тканей [3].
Теломеразная активность при ГКК проанализирована в ряде работ. Было показано соответствие повышения уровня теломеразной активности и уровня мРНК ИТБЯТ плохому прогнозу выживания [8]. Для гепатобластом есть данные о росте экспрессии мРНК ИТБЯТ [4, 5]. В единственной работе [9] была показана корреляция высокой активности теломеразы с плохим прогнозом для гепатобластом, но деление групп по активности выполнялось произвольно. В отличие от ГКК, гепатобластома возникает из эмбриональных клеток печени, находящихся на разных стадиях развития и утративших свои нормальные функции. Следовательно, теломераза может быть исходно активна в исследуемом типе клеток, поэтому в данном случае важна ее количественная оценка.
При количественной оценке теломеразной активности перед исследователями возникает проблема сравнения результатов, полученных в разных работах. Нет общепринятой шкалы активности теломеразы. Нередко в качестве стандартов используются образцы разных клеточных линий. Известно, что даже в клетках одной и той же линии, длительное время культивируемых в разных лабораториях, собранных на разных этапах роста, активность теломеразы в пересчете на одну клетку может различаться в несколько раз.
ТЕЛОМЕРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ
485
Целью нашего исследования стала разработка универсальной шкалы величины теломеразной активности и оценка с её помощью теломеразной активности в клетках печени при разной патологии (гепатобластома, ГКК, невирусный, неалкогольный цирроз, гигантская мезенхимальная га-мартома).
В работе анализировали ряд клинических случаев, послуживших показанием к трансплантации печени или обширной резекции её части. Было проведено количественное сравнение уровня активности теломеразы в образцах, полученных из пораженных и нормальных тканей печени, и мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК), имеющих нормальные показатели те-ломеразной активности.
В работе использовали материалы от пациентов (с их информированного согласия), которым проводили гепатэктомию с последующей ортото-пической трансплантацией части печени от живого родственного донора, либо расширенную резекцию части печени в Отделении педиатрической и взрослой трансплантации печени ФГБУ РНЦХ им. академика Б.В. Петровского РАН. Забор образца ткани печени проводили инцизион-ным способом на фоне сохраняющегося кровотока до лигирования сосудов печени. После забора материалы сразу замораживали и в дальнейшем хранили в контейнере с жидким азотом. Материалы верифицировали по патоморфологическим критериям.
МКПК, полученные из ГНИИ центра профилактической медицины, выделены по стандартной процедуре в градиенте плотности фиколла-верографина непосредственно после взятия крови от пациентов с их информированного согласия. Время хранения и транспортировки составляло 3 ч. Образцы МКПК содержали при 0—4°C.
Приготовление экстрактов клеток контрольной клеточной линии HEK293 и МКПК. Клетки ресус-пендировали в лизирующем буфере, который содержал 10 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 1.0 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА, 5 мМ ß-меркаптоэтанол, 5%-й глицерин, 0.5% ЧАПС (3-[(3-холамидопропил)диметил-аммоний]-1-пропансульфонат), 0.1 мМ ФМСФ (фенилметилсульфонилфторид). Далее инкубировали в течение 30 мин на льду, центрифугировали 10 мин при 4°C и 16000 g. Полученный суперна-тант делили на аликвоты и замораживали в жидком азоте.
Приготовление экстрактов из образцов операционного материала. Замороженные образцы тканей (~0.01—0.1 г) разрушали с помощью дезинтегратора Micro-Dismembrator U ("B. Braun Biotech International", Германия) в режиме охлаждения жидким азотом, переносили в находящийся во льду гомогенизатор Даунса, в который помещали лизирующий буфер из расчёта 1.5—2.0 мл на
0.1 грамма ткани, и делали не менее 5—7 тракций пестиком. Образовавшуюся суспензию переносили в пробирку объемом 1.5 мл и оставляли на льду на 30 мин. Затем образцы в пробирках центрифугировали в течение 15 мин при 16000 g и 4°С. Надосадоч-ную жидкость разделяли на аликвоты, замораживали в жидком азоте и хранили при —80°C. Содержание белка определяли по методу Бредфорда.
Определение теломеразной активности (TRAP) проводили по методу [7] с некоторыми модификациями. На первом этапе готовили 25 мкл смеси TRAP, содержащей однократный TRAP-буфер [20 мМ HEPES-KOH, pH 8.3, 1.5 мМ MgCl2, 63 мМ KCl, 1 мМ ЭГТА, 0.1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 0.005% по объёму твина 20, 20 мкМ дНТФ, 0.6 мкМ олигонуклеотида ТС (aatccgtcgagcagagtt)] и экстракт клеток клеточных линий или тканей (2 мкг суммарного белка в 4 мкл на одну реакцию). Реакционную смесь инкубировали в течение 30 мин при 25°C. На втором этапе к смеси добавляли 1 ед. Та#-ДНК-полимеразы ("Хе-ликон", Россия), 0.6 мкМ олигодезоксинуклеотида ACX (gcgcggcttacccttacccttaccctaacc), 0.15-кратный SybrGreen I ("Invitrogen", США) и проводили ПЦР по следующей схеме: 35 c 94°C, 35 с 50°C, 90 с 72°C, считывание сигнала флуоресценции при 72°С (35 циклов, амплификатор C1000CFX96, "Bio-Rad", США).
В качестве положительного контроля использовали экстракт клеток HEK293, в которых присутствует активная теломераза. Для контроля специфичности сигнала для каждого образца использовали клеточный экстракт, обработанный перед TRAP-тестом РНКазой А.
В качестве стандарта для оценки уровня тело-меразы, который можно было бы связать с какой-либо физиологической нормой, использовали 57 образцов МКПК из коллекции Института профилактической медицины. Поскольку изначально не было информации о количественном уровне активности в клетках МКПК, за единицу активности (ед. акт.) была принята активность экстракта из 20 клеток линии HEK293, имеющейся в нашей лаборатории (клетки этой же линии используются в коммерчески доступных наборах в качестве контрольного образца). Для того чтобы построить биологически обоснованную шкалу активностей теломеразы, серия образцов клеток МКПК, показывающих в норме некоторую тело-меразную активность, была разбита на четыре группы по уровню активности. При этом в каждой группе было одинаковое количество образцов (квартили). При разбиении на квартили для определения биологических норм оказалось, что медиана активности в МКПК составляет 0.44 ед. акт. Границы нижнего и верхнего квартилей находятся на уровне 0.35 и 0.78 ед. акт. Неактивными считали образец ГКК, полученный от одного пациента после обработки экстракта РНКазой А, и
486
СКВОРЦОВ и др.
Таблица 1. Показатели теломеразной активности по шкале, разработанной на основе изучения МКПК в образцах пациентов с разной патологией печени
Уровень активности теломеразы, интервал (усл. ед.) Высокая (0.78—5) Средняя (0.35—0.78) Низкая (0.05—0.35) Очень низкая (0.01—0.05)
Гепатобластома 1/6 1/6 1/6 1/6
Нормальная ткань больных с гепатобластомой 1/8 2/8
Злокачественная эпителиальная опухоль (ГКК) 1/1
Нормальная ткань пациента со злокачественной эпителиальной опухолью
Гигантская гамартома печени
Региональный лимфоузел пациента с гамартомой 1/1
Невирусный, неалкогольный цирроз 1/2 1/2
Нормальная ткань от здорового донора части печени
Нет (0.01-0.00)
2/6 5/8
1/1 1/1
3/3
контрольный образец, в которых аналитические сигналы ПЦР в реальном времени достоверно не различались, и уровень сигнала составлял не выше 0.01 ед. акт.
Все образцы печени, соответствующие нижнему квартилю, были отнесены к образцам с низкой активностью (ниже 0.35 ед. акт.), а образцы второго и третьего квартилей с 0.35-0.78 ед. акт. — со средней активностью. Все образцы, относящиеся к уровню активности верхнего квартиля (свыше 0.78 ед. акт.), были отнесены к группе с высокой активностью.
Была протестирована активность теломеразы в серии из 23 образцов нормальных и опухолевых тк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.