ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 2, с. 205-211
= ЭКОЛОГИЯ
УДК 631.46:547.995.12
ТЕМПЕРАТУРА КАК АУТЭКОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКТОР ФОРМИРОВАНИЯ ХИТИНОЛИТИЧЕСКОГО МИКРОБНОГО
КОМПЛЕКСА В ПОЧВАХ
© 2007 г. Н. А. Манучарова, А. Н. Власенко, А. Л. Степанов
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет почвоведения,
119992 Москва, Ленинские горы
E-mail: manucharova@mail.ru Поступила в редакцию 05.06.2006 г.
Газохроматографическим методом изучена динамика эмиссии диоксида углерода из почв в ходе хи-тинолитической сукцессии, инициированной увлажнением и внесением хитина, при различных температурах (5, 27, 50°С). Методом люминесцентной микроскопии проведена оценка численности и биомассы хитинолитического грибного, бактериального и актиномицетного комплексов в почвах. Установлено, что при всех исследуемых температурах в почвах наблюдается активное развитие хитинолитического микробного комплекса. Наибольший рост хитинолитических микроорганизмов отмечен при высоких температурах на ранних стадиях сукцессии, при низких температурах - на поздних стадиях. Высокие температуры обеспечивают наиболее активное развитие хитинолитического микробного комплекса в почвах, приуроченных к теплым климатическим зонам (бурая пу-стынностепная почва), низкие температуры - в почвах умеренных зон (серая лесная почва). Наиболее активно развивающейся группой среди хитинолитиков в образцах исследуемых почв были ак-тиномицеты как в условиях низких, так и высоких температур.
Температура почв разных природных зон резко различается. Действие температуры на рост микроорганизмов обусловливается ее непосредственным влиянием на скорость химических реакций и на состояние макромолекулярных компонентов клетки (вязкость мембран, конформацию белков и т.д.). Известно, что наибольшая активность многих ферментов приурочена к повышенным температурам и находится в диапазоне от 45 до 55°C. В частности, эндохитиназный ген, выделяемый как из прокариотных микроорганизмов (гр-бактерий Serratia marcescens (Ruiz-Sancheza, 2005)), так и из эукариот (грибов (Pankaj, 2005)) обладает пиком ферментативной активности при температурах 55 и 40°C соответственно. В частности, в результате антропогенной деятельности, например, развития горячего водоснабжения, происходит расширение зон активности термотолерантных и даже термофильных микроорганизмов в почвах (Нетрусов и др., 2004). Учитывая возможность перехода микробного сообщества с одного трофического маршрута на другой в зависимости от условий, в частности от температуры, актуальным представляется вопрос о вкладе разных групп микроорганизмов в разрушение хитина в почвах под воздействием разных температур.
Хитин является одним из наиболее существенных органических полимеров в природе, занимая второе после целлюлозы место по распространенности среди полисахаридов (Kang, 2005; Zelentski,
Akopova, 2001). Он представляет собой полимер Р-(1,4)-^ацетил-0-глюкозамина, входящий в состав клеточных стенок грибов и покровов беспозвоночных животных. Его содержание может достигать десятых долей процентов от массы почвы (Кгеек, 2001). Особого внимания заслуживают огромные количества отходов микробиологических производств на основе грибов, одним из важнейших компонентов которых является хитин (Гальбрайх, 2001).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования явились образцы гумусовых горизонтов почв следующих типов: чернозема типичного, серой лесной и бурой пустын-ностепной почвы (табл. 1).
Опыт ставили следующим образом: навеску почвы помещали в пенициллиновые флаконы, увлажняли водой до 50% от массы почвы, предин-кубировали в течение недели при различных температурах (5, 27 и 50°С), после чего в опытные варианты добавляли хитин в количестве 0.6% от массы почвы (30 мг/5 г почвы). За развитием сукцессии наблюдали в течение месяца. Проводили отбор почвенных проб на 1, 3, 10, 20, 30 и 40-е сут опыта после внесения хитина в почвы. Контролем служила увлажненная водой почва. Повторность пятикратная.
Таблица 1. Характеристика исследованных образцов почв
Почва Место взятия образцов Горизонт, глубина отбора проб, см рН водный Сорг, %
Чернозем типичный глубококарбонатный тяжелосуглинистый Воронежская обл., Таловский р-н 5-15 6.8 2.9
Серая лесная типичная бескарбонатная глубокая на покровном суглинке Тульская обл., Щекинский р-н 8-20 4.9 1.5
Бурая пустынностепная песчаная Монголия, Средне-Гобийский аймак 2-10 8.1 0.64
Интенсивность микробного разложения хитина в почвах оценивали на основе сравнения скорости эмиссии диоксида углерода из почв с хитином и из контрольных образцов, а также по возрастанию численности и биомассы разных групп микроорганизмов (бактерий, актиномицетов и грибов) в почвах с хитином по сравнению с контрольными вариантами. Динамику эмиссии диоксида углерода из почвы оценивали газохроматографи-чески (Методы..., 1991). Накопление диоксида углерода в газовой фазе над образцами определяли спустя сутки инкубации при заданных температурах. Отбор проб проводили ежедекадно, анализируя их в пятикратной повторности.
Численность бактерий, длину мицелия актиномицетов и грибов в хитинолитическом микробном комплексе определяли с помощью метода люминесцентной микроскопии в ходе сукцессии, инициированной увлажнением и внесением хитина (Методы., 1991). Для окрашивания бактерий использовали водный раствор акридина оранжевого (разведение 1 х 10000; 2-4 мин), для грибов -раствор калькофлора белого (разведение 1 х х 10000; 15 мин). Количество микробных клеток для бактерий или длину мицелия для актиномицетов и грибов вычисляли по формуле:
М = 4ап х 1010/р,
где М - количество клеток (или длина мицелия) в 1 г увлажненной почвы (50% от массы абсолютно сухой почвы); а - среднее число клеток в поле зрения; р - площадь поля зрения, мкм2; п - показатель разведения. Биомассу (мг/г почвы) бактерий, мицелия актиномицетов и грибов также определяли расчетным методом (Кожевин, 1989):
Бб = 2М х 102 - биомасса бактерий,
Бма = 3.9М х 105 - биомасса мицелия актиномицетов,
Бмг = 2.98М х 103 - биомасса мицелия грибов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Эмиссия диоксида углерода из образцов почв с хитином была выше по сравнению с контролем при всех исследованных температурах (рис. 1). Контрольные образцы характеризовались стабильными значениями эмиссии диоксида углерода на протяжении всего эксперимента, вследствие их прединкубации, сформировавшей стабильное микробное сообщество к моменту начала опыта. Рассмотрение динамики эмиссии диоксида углерода из почв с добавлением хитина при различных температурах выявило определенные особенности: в зависимости от температуры, абсолютные максимальные значения эмиссии диоксида углерода отмечались в разные сроки эксперимента. При минимальной температуре пик активности наблюдался к концу 3-й нед эксперимента, при 27°С - к концу 1-й нед, а при 50°С - уже на первые сутки опыта (рис. 2). Эксперименты по определению динамики численности и биомассы микроорганизмов в ходе хитинолитической микробной сукцессии в образцах почв, инкубируемых при разных температурах, подтвердили полученные нами зависимости активности дыхания. При минимальной температуре наибольшая общая численность и биомасса всех микроорганизмов в образцах почв с хитином обнаруживалась к концу 3-й нед эксперимента, при 27°С - к концу первой недели, а при максимальной - уже на первые сутки опыта (табл. 2).
Таким образом, при всех исследуемых температурах наблюдали активное развитие хитинолити-ческого микробного комплекса в ходе сукцессии, причем, при высоких температурах инкубирования наибольшая эмиссия диоксида углерода, численность и биомасса хитинолитических микроорганизмов отмечается на ранние сроки эксперимента, при более низких температурах - на поздние.
Констатировать разложение хитина корректно только при сравнении опытных вариантов с контролем. По абсолютным величинам эмиссии диоксида углерода или численности микроорганизмов в вариантах с хитином можно судить о ди-
(а)
(а)
15 22 29
36
н ?
3
я ^
о к
(б)
О и
л ч о
250 200 150 100 50 0
(в)
120 100 80 60 40 20 0
1 3 7 10 14 21 28 35 42
Сутки
Рис. 1. Динамика эмиссии диоксида углерода из серой лесной почвы в вариантах с хитином и без него при различных температурах: а - 5°С, б - 27°С, в - 50°С (для рис. 1, 3, 5). 1 - хитин; 2 - контроль. Д.и. - доверительный интервал.
намике развития хитинолитической микробной сукцессии, но не об интенсивности разложения хитина в почвах. В связи с этим мы использовали коэффициенты трансформации хитина (КТХ) и микробного отклика на хитин (КМОХ):
КТХ = а/Ь, где а - эмиссия СО2 из почвы с хитином, Ь - эмиссия СО2 из контрольной почвы;
КМОХ = c/d, где с - биомасса микроорганизмов в почве с хитином, d - биомасса микроорганизмов в контрольной почве.
Оценка КТХ в почвах показала, что при низкой температуре (5°С) наиболее активно хитин разлагался в серой лесной почве, при повышенной (50°С) - в бурой пустынностепной почве (рис. 3).
80 60 40 20 0
т
Е^
3
я ^
о к
(ч
о и
л
4 о
к
3
250 200 150 100 50 0
500 400 300 200 100 0
- у-''к„
20
30
27 50
и °с
(б)
30
27 50
и °с
(в)
30
27 С
Рис. 2. Динамика эмиссии диоксида углерода из исследуемых почв с хитином при разных температурах: а - бурая пустынностепная почва; б - серая лесная почва; в - чернозем типичный.
Такие же закономерности были получены и при рассмотрении КМОХ. При высокой температуре этот коэффициент был наибольшим в бурой пустынностепной почве (рис. 4а), а при низкой температуре - в серой лесной почве (рис. 46). Важ-
1
8
Таблица 2. Динамика микробной биомассы в образцах почв при их инкубировании с хитином и без него, мг/г почвы
Сутки
Группа 1 е 10-е 20-е 30-е
контроль хитин контроль хитин контроль хитин контроль хитин
Бурая пустынностепная почва 5°С
Бактерии 0.018 0.018 0.018 0.035 0.011 0.026 0.011 0.024
Актиномицеты 0.006 0.006 0.013 0.019 0.015 0.034 0.016 0.035
Грибы 0.015 0.015 0.015 0.016 0.029 0.059 0.029 0.058
Общая биомасса 0.039 0.039 0.046 0.070 0.055 0.119 0.056 0.117
27°С
Бактерии 0.013 0.018 0.008 0.016 0.019 0.024 0.017 0.026
Акти
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.