СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2012, том 26, № 2, с. 141-149
_ ЗРИТЕЛЬНАЯ _
СИСТЕМA
УДК 612.843.116.1
ТЕМПЕРАТУРНАЯ ЗАВИСИМОСТЬ МЕДЛЕННЫХ СТАДИЙ ФОТОЛИЗА РОДОПСИНА В ИНТАКТНЫХ ПАЛОЧКАХ СЕТЧАТКИ ЛЯГУШКИ И КРЫСЫ
© 2012 г. Д. А. Кореняк, В. И. Говардовский
Учреждение Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН 194223 Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44 E-mail: vgovardovsky@yahoo.com
Поступила в редакцию 12.10.2011 г.
При помощи скоростного поляризационного микроспектрофотометра было изучено влияние температуры на фотолиз родопсина в интактных палочках лягушек (Rana temporaria) и крыс линии Вистар. Измерения проводились в диапазоне температур 17-37 °С. Было обнаружено, что качественно сходный ход процессов фотолиза родопсина у лягушки и крысы сопровождается отличиями в кинетике взаимопревращений фотопродуктов. С повышением температуры процессы фотолиза ускоряются у обоих животных, однако фотолиз родопсина лягушки протекает примерно в 10 раз быстрее, чем родопсина крысы при той же температуре.
Ключевые слова: палочки, родопсин, метародопсины, фотолиз, температурная зависимость, лягушка, крыса.
ВВЕДЕНИЕ
Зрительный пигмент палочек сетчатки - родопсин - состоит из апобелка опсина и хромофорной группы - ретиналя, которая в темновом состоянии находится в 11-цис изомерной форме. Поглощение фотона молекулой родопсина вызывает изомеризацию ретиналя в транс-конфигурацию. Цис-транс переход сопровождается кон-формационными изменениями в опсине, которые через серию быстрых стадий приводят к появлению равновесной смеси метародопсинов I и II. Мета II является каталитически активной формой пигмента, запускающей каскад фототрансдукции (обзоры: DeGrip, Rothschild, 2000; Pugh, Lamb, 2000; Yau, Hardie, 2009). Мета I и II частично переходят в метародопсин III. Дальнейшие медленные процессы (минуты и десятки минут) приводят к разрыву ковалентной связи транс-ретиналя с опсином и высвобождению ретиналя из хромофорного центра, т.е. происходит фотолиз родопсина.
Для восстановления способности родопсина сигнализировать о получении следующего све-
тового кванта необходимо возвратить молекулу пигмента в исходное "темновое" состояние. Регенерация пигмента в фоторецепторах позвоночных происходит в результате цепочки биохимических реакций - зрительного цикла (обзоры: Шуколю-ков, 1999; Говардовский и др., 2004; Lamb, Pugh, 2004). Начальные и конечные стадии зрительного цикла палочек - фотолиз родопсина, превращение транс-ретиналя в транс-ретинол и рекомбинация опсина с 11-цис хромофором - протекают в самих фоторецепторах, а обратное превращение трансретинола в 11-цис-ретиналь происходит в клетках пигментного эпителия глаза.
Медленные стадии фотолиза, в ходе которых происходит распад долгоживущих продуктов (метародопсинов), необходимы для того, чтобы освободить хромофорный сайт на опсине и сделать его доступным для связывания новой молекулы 11-цис-ретиналя. Кроме того, образовавшийся транс-ретинол служит субстратом для последующих стадий зрительного цикла, в ходе которых синтезируется "темновой" хромофор (11-цмс-ретиналь). Поэтому процессы фотолиза, происходящие в наружном сегменте фоторецеп-
тора, являются одной из ключевых стадий зрительного цикла.
Показано, что многие заболевания сетчатки связаны с нарушением процессов регенерации родопсина и восстановления чувствительности фоторецепторов при переходе от высоких осве-щенностей к низким - темновой адаптации (обзоры: Saari, 2000; Baehr et al., 2003; Kuksa et al., 2003; Thompson, Gal, 2003; Lamb, Pugh, 2004; Travis et al., 2007). Это делает необходимым изучение всех стадий цикла зрительного пигмента у потенциальных животных-моделей и у человека. Однако большинство работ по процессам фотолиза и регенерации родопсина выполнено в условиях in vitro на детергентных экстрактах зрительного пигмента и биохимических препаратах фоторецепторных мембран. Очевидно, что такой подход не позволяет детально охарактеризовать реальную ситуацию в интактных фоторецепторах, поскольку поведение зрительного пигмента в экстракте может существенно отличаться от его поведения в интактной клетке. Кроме того, помимо целостности фоторецепторов, существенное влияние на состав продуктов и кинетику их взаимопревращений должна оказывать температура, при которой проводились исследования. В то же время большинство экспериментов на родопсине млекопитающих проводилось in vitro при комнатной и более низких температурах. Неизвестно, насколько результаты этих работ справедливы для фоторецепторных клеток in vivo. Наконец, одна из ключевых стадий зрительного цикла внутри фоторецептора - восстановление транс-ретиналя в транс-ретинол - критически зависит от клеточного метаболизма и принципиально может изучаться только на интактных фоторецепторах в состоянии, близком к физиологическому (Kolesnikov et al., 2007; Chen et al., 2009).
При помощи скоростного поляризационного микроспектрофотометра мы исследовали влияние температуры на медленные стадии фотолиза родопсина в интактных палочках лягушек (Rana temporaria) и крыс линии Вистар в условиях, приближенных к физиологическим. Выбор лягушки в качестве одного из объектов вызван тем, что ранее был разработан подход к количественному анализу индивидуальных реакций фотолиза родопсина в палочках этого животного (Kolesnikov et al., 2003). Это дает возможность детально сравнивать процессы фотолиза родопсина при различных температурах. Что касается крыс, в 1970-х годах несколько линий крыс активно использовались как модели для изучения наследственной
дегенерации сетчатки (пигментного ретинита) у человека (обзор LaVail, 2001). В дальнейшем интерес исследователей в значительной мере сместился к мышам, как объекту, дающему лучшие возможности для генетических манипуляций. В последнее десятилетие, однако, значительно выросло число линий крыс - моделей разных форм дегенерации сетчатки. Сейчас работы на сетчатке крыс ведутся так же активно, как на сетчатке мышей. В то же время фотолиз родопсина в палочках крысы практически не исследован.
Мы охарактеризовали кинетику образования и распада индивидуальных продуктов фотолиза родопсина лягушки и крысы в диапазоне температур 17 - 37 °С и нашли, что качественно сходный ход процессов фотолиза родопсина у этих животных сопровождается отличиями в кинетике взаимопревращений долгоживущих продуктов. С повышением температуры процессы фотолиза ускоряются у обоих животных, однако фотолиз родопсина лягушки протекает значительно быстрее, чем родопсина крысы при той же температуре.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили на интактных палочках сетчаток травяных лягушек (Rana temporaria) и белых крыс линии Вистар. Животных адаптировали к темноте не менее 12 ч перед началом эксперимента и затем умерщвляли при тусклом красном свете; последующие манипуляции по извлечению сетчатки из глаза проводили под контролем инфракрасной телевизионной системы.
Выделенную сетчатку помещали в физиологический солевой раствор, состав которого зависел от вида животного. Базовый физиологический раствор для лягушки содержал: NaCl (110 мМ); KCl (2.5 мМ); MgSO4 (1 мМ); CaCl2 (1 мМ); ЭДТА (20 мкМ); глюкозу (10 мМ); Na-HEPES pH 7.5 (10 мМ). В состав раствора для крысы входили: NaCl (149 мМ); KCl (3.6 мМ); MgCl2 (2.4 мМ); CaCl2 (1.2 мМ); ЭДТА (20 мкМ); глюкоза (10 мМ); Na-HEPES pH 7.5 (10 мМ).
Измерения проводили на препаратах в проточной камере, при перфузии физиологическим раствором. Температуру раствора и камеры регулировали в диапазоне 17 - 40 °С и измеряли тонкой термопарой в непосредственной близости от исследуемого участка образца.
Спектры поглощения зрительных пигментов регистрировали при помощи скоростного поляризационного микроспектрофотометра (Говар-
довский, Зуева, 2000) при двух направлениях поляризации измерительного светового луча: перпендикулярно оси наружного сегмента (Т-по-ляризация) и вдоль оси наружного сегмента (Ь-по-ляризация). Это позволяло идентифицировать спектрально сходные продукты, отличающиеся ориентацией хромофорной группы в мембране (Кокэшкоу et а1., 2003).
Спектры поглощения родопсина лягушки регистрировали от изолированных наружных сегментов палочек (НСП) и одиночных интактных палочек. Ширина измерительного светового луча составляла около 2 мкм, длина от 20 до 30 мкм. Поскольку палочки сетчатки крысы слишком тонки, чтобы выполнять измерения на одиночных НСП, спектры поглощения регистрировали на "щетке" палочек, видных на краю кусочка сетчатки. Измерения на "щетке" НСП проводили при помощи широкого измерительного луча (~ 50 х 10 мкм), покрывающего десятки НСП.
Первичную обработку экспериментальных данных проводили при помощи компьютерной
программы, написанной в лаборатории. Этапы обработки и анализа результатов подробно описаны ранее (Голобокова и др., 2003; Ко1езшкоу et а1., 2003).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Спектральные изменения при фотолизе. На рис. 1 представлены спектры поглощения, показывающие взаимопревращения продуктов после обесцвечивания родопсина 525-нм вспышкой света в изолированных НСП лягушки и интакт-ных палочках крысы при 37 °С. Шум на экспериментальных кривых обусловлен квантовыми флуктуациями измерительного светового луча (ЫеЪшап, 1972; Говардовский и Зуева, 2000).
Спектр поглощения темноадаптированных НСП, с максимумом около 500 нм (кривые 0), соответствует родопсину. Отличие амплитуд спектров, записанных при Т- и Ь-поляризациях, показывает, что хромофорная группа родопсина ориентирована преимущественно в плоскости
0.08
й 0.06
Лягушка
-1-1-г
450 500 550 600 650
350 400 450 500
Длина волны, нм
550 600 650
Рис. 1. Спектральные изменения при фотолизе родопсина в палочках лягушки (а, б) и крысы (в, г) при 37 °С. Записи при двух направлених поляризации измерительного луча (Т и Ь). Кривые 0 - исходный спектр поглощения темнового родопсина, 1 - непосредственно после обесцвечивающей вспышки (525 нм, 2 с); последующие кривые зарегистрированы через разные интервалы времени после вспышки. Для лягушки - кривая 2 - 20, 3 - 30, 4 - 300 с. Промежуточные записи при 10, 50, 100 и 200 с опущены. Для крысы - кривая 2 -
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.