БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Том 20 * № 1 * 1994
УДК 577.338
© 1994 С. JI. Александров
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
V*. С-КОНЦЕВАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ
Институт биоорганической химии им М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова
РАН, Москва
Методом молекулярной механики проанализированы тетра-эдрические интермедиаты ацилирования а-химотрипсина N-замещен-ными амидами дипептидов. Установлена доминирующая роль С-концевых взаимодействий как в кинетической специфичности, так и в специфичности протонирования уходящей группы. Показано, что кинетическая специфичность сериновых протеиназ определяется переходом между двумя формами тетраэдрического производного субстрата на предстационарной стадии.
Вторичная специфичность протеиназ (см., например, [2]), т. е. их специфичность к удаленным от реагирующей группы фрагментам субстрата (в частности, к С-концевому [3—5]), сильно влияет на скорость протеолиза.
Влияние вторичных взаимодействий с субстратом по-разному сказывается у протеиназ различных типов. Так, связанная с ними разница в скорости протеолиза достигает пяти порядков у пепсина [6], тогда как у а-химотрипсина вариации Р_гостатка всего в 10—100 раз изменяют специфичность, оцениваемую величиной отношения kcal/Km [4]. Во многих случаях вторичные взаимодействия проявляются в изменении Аса1, но не Кт [7].
В случае же процессинга белков протеиназами обоих типов, например при активации трипсиногена энтеропептидазой [8] и ангиотензиногена ренином [9], эти взаимодействия становятся доминирующими и определяют абсолютную специфичность протеиназ, которая необходима для регуляторных функций in vivo
Экспериментальные исследования пока не могут выявить природу такого сильного влияния вторичных взаимодействий, и потому естественно искать ответ, обращаясь к компьютерному моделированию, в частности к методу молекулярной механики.
Согласно развиваемой в нашей лаборатории концепции [11, 12], эффективность и специфичность протеиназ обусловлена тем, что фермент стабилизирует продуктивный комплекс с субстратом. Такой стабилизации могут способствовать вторичные фермент-субстратные взаимодействия, которые компенсируют повышение свободной энергии, связанной с исчезновением ря-сопря-женной амидной группы [13].
В настоящей работе с помощью сравнительного анализа структур тетра-эдрических производных субстратов удалось объяснить кинетическую
* Сообщение [V см. ¡1].
[10].
Кинегические параметры исследуемых субстратов [5]
Субстрат * k с"1 cat > c Km, mM C-'M 1
AcPhe-GlyNH2 0,14 14,6 9,6
AcPhe-AlaNH2 2,8 25 112
AcPhe-ValNH2 0,46 12,4 37,6
Расщепляется амидная связь между аминокислотными остатками.
специфичность сериновых протеиназ и показать ее связь с протонированием амиднош N-атома уходящей группы субстрата.
Молекулярная механика применялась для анализа нековалентных комплексов протеолитических ферментов с субстратами (см., например, [14]), но не для сопоставления структур тетраэдрических промежуточных производных с целью определить их связь с кинетической специфичностью и протонированием уходящей группы.
Методы и условия расчета. Метод молекулярной механики нельзя применять для сравнительной оптимизации нековалентных фермент-субстратных взаимодействий, так как он приводит к непродуктивности комплексов [15], однако он вполне уместен для анализа тетраэдрических интермедиатов.
В расчетах использовали программу, позволяющую анализировать конфор-мационные возможности субстратов и некоторых участков фермента в поле атомов белка. Программа использовала: 1) значения потенциалов Леннарда — Джонса, предложенные Скоттом и Шерагой [16] для анализа нековалентных взаимодействий, 2) заряды на атомах [17] для вычисления электростатической энергии,
3) торсионные потенциалы связей [18], 4) потенциалы типа Морзе для оценки энергии водородных связей [19], 5) стандартные геометрические параметры производных аминокислот [18].
Значения двугранных углов приведены согласно стандартной номенклатуре [20]. Диэлектрическая проницаемость соответствовала слабополярной среде (в = 4), а оптимальное значение энергии водородной связи было выбрано равным 1,5 ккал/моль.
Некоторые торсионные потенциалы и заряды на атомах определяли методом CNDO/2 (программа «GEOMO» [21]).
Рассчитываемые системы. В качестве субстратов были выбраны близкие по структуре уходящей группы амиды дипептидов AcPhe-XNH, (X = -Gly-, -Ala- и -Val-), у которых Кш отличалась не более чем в 2 раза, а кш — примерно в 20 раз [5]. Это означает, что при их гидролизе разница в константах скорости второго порядка kCM/Km отражает главным образом кинетическую специфичность фермента (табл. 1).
В качестве фермента был выбран малоспецифичный а-химотринсин, у которого минимальны электростатические и другие специфические взаимодействия с субстратами. Это позволило выявить наиболее общие аспекты С- концевой специфичности протеолиза сериновыми протеиназами. Использовали координаты атомов как нативного [22, 23], так и тозил-а-химотрипсина [24]. Локализацию протонов проводили на основе стехиометрии.
В расчет включали остатки белка, атомы которых расположены на расстоянии 8—10 А от атомов ближайших остатков белкового панкреатического трипсиново-го ингибитора в фермент-ингибиторном комплексе [25]. К ним относятся сегменты полипептидной цепи фермента 16—20, 32—43, 54—61, 95—104, 140—146, 149— 152, 183—199 и 209—229 — всего 84 аминокислотных остатка.
Рис. 1. Рассчитываемые модели тетраэдрических производных субстратов типа AcPhe-XNH2 и ориентационные параметры, характеризующие их взаимодействия с остатками связывающего и каталитического центров фермента; R — боковые цепи уходящих групп тетраэдрических производных
Кроме полной оптимизации геометрии тетраэдрических производных субстратов определяли локализацию боковых цепей остатков активного центра белка, а именно остатков His57, Asp 102, Met 192 и Serl95.
Оптимизацию, в отличие от предшествующих расчетов, проводили с очень малым критерием выхода — не более 0,05 ккал/моль (ср., например, [14]), что позволило выявить ряд тонких отличий в геометрии тетраэдрических производных с различными уходящими группами.
Структура тетраэдрических производных субстратов и параметры, характеризующие их ориентацию относительно наиболее важных остатков активного центра фермента, приведены на рис. 1.
Геометрические параметры тетраэдрического производного N-метиламида N-ацетил-£-феяилаланина, включая двугранный угол т (см. рис. 1), рассчитанный ранее в поле атомов а-химотрипсина [26], использовали в качестве исходных данных при сравнительном расчете интермедиатов протеолиза, протонированных по №2-атому остатка His57. Торсионный потенциал реакционной амидной связи в этих производных был взят равным 4 ккал/ моль.
Структура тетраэдрических интермедиатов протеолиза. Сравнительный анализ показал, что для трех амидов дипептидов конформации субстратного компонента и боковых цепей каталитически важных остатков белка практически одинаковы, несмотря на различия в структуре уходящих групп. В то же время конформация субстратного компонента в интермедиате кардинально отличалась от конформации этих субстратов в нековалентных комплексах. Это указывало на
Значения абсолютных величин энергии рассчитываемых систем и двугранных углов для субстратов и боковых групп фермента, ответственных за специфичность
Субстрат ♦ 8ег195 Ме«9:
Рассчитываемая система Р -остаток Р .-остаток Е, ккал/моль
Ф, (0, х! X? Ф-1 Ф-1 х1 X2
Нековалентный
комплекс **:
X = -в1у- -98 37 177 — 82 -50 -84 — 151 32 143 -35,1
-А1а- —97 39 176 -83 -51 -84 — 153 32 142 -32,8
-Уа1- -97 38 179 — 81 -52 —84 — 158 33 144 — 16,9
Тетраэдрические
промежуточные
производные
ТЕТШ:
X = -в!у- -110 41 124 —52 141 -86 -156 —47 135 0,7
-А1а- -113 48 122 —53 146 — 87 -173 -50 126 29,2
-Уа1- -116 48 119 -53 147 -85 179 -50 121 — 7,3
ТЕТЯ2:
X = -Иу- — 111 38 72 -49 141 — 161 -151 -51 143 -21,8
-А1а- -113 40 75 -51 140 — 145 — 162 -52 142 -26,8
-Уа1- -124 39 73 -50 139 — 136 -171 -51 142 -31,8
Бычий панкреатический ингибитор трипсина ***
— 117 39 164 -63 — 172 — 88 164 -83 68 —
См. рис. 1 (X — уходящая группа).
Результаты сравнительного (информационного анализа [15].
Результаты рентгеноструктурного анализа комплекса этого ингибитора и ^-трипсина [25].
то, что нуклеофильная атака включает конформационную перестройку субстратов (табл. 2) [15].
Имеются две главные особенности, характеризующие рассчитанные тетра-эдрические интермедиаты.
Первая из них заключается в том, что эти производные по своей структуре очень близки к комплексам сериновых протеиназ с природными белковыми ингибиторами [27], в частности р-трипсина с бычьим панкреатическим ингибитором трипсина [25]. Если в таких комплексах ингибитор заменить на субстрат, должно иметь место сильное взаимодействие карбонильного О-атома субстрата с остатками «оксианионной полости» (г, и г2; табл. 3). Такое взаимодействие очень сильно поляризует реакционную связь, приводя к значительному перераспределению электронной плотности.
В нековалентных комплексах [15] (табл. 3) гидролизуемая связь занимает иное положение относительно «оксианионной полости», и в ней не происходит перераспределение электронной плотности, увеличивающее ее электрофильность до уровня, достаточного для запуска гидролитического процесса [13, 15].
Таким образом, наши расчеты согласуются с концепцией о стабилизации субстрата в продуктивном комплексе [12], который структурно сходен с тетра-
Геометрические параметры рассчитываемых систем, определяющие электрофильную активацию субстратов и ответственные за специфичность переноса протона на уходящую
группу
Рассчитываемая система* г„ А г2< А А ^ , 5* , град ¿2 6\ град
Нековалентный комплекс *:
X = -СТу- 2,84 3,76 — — —
-А1а- 2,80 3,74 — — —
-Уа1- 2,82 3,75 — — —
Тетраэдрические промежуточные производные
ТЕТЯ!:
X = -Иу- 2,38 1,86 1,23 74 —28
-А1а- 2,39 1,70 1,34 85 9
-Уа1- 2,40 1,72 1,19 86 25
ТЕТЯ2
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.