ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 6, с. 680-687
УДК 581.19
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ОПТИМИЗАЦИИ РЕЖИМОВ ПОСЛЕУБОРЧНОЙ ОБРАБОТКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ,
СИНТЕЗИРУЮЩИХ АЛКАЛОИДЫ
© 2004 г. М. Я. Ловкова*, Г. Н. Бузук** , С. М. Соколова***
*Институт биохимии им. АН. Баха РАН, Москва, 119071, e-mail: inbio@las.apc.org ** Витебский медицинский университет, Витебск, 210026 Белоруссия,
e-mail: buzukg@mail.ru *** Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина, РАН, Москва, 127276,
e-mail: gbs@aix.ru Поступила в редакцию 25.12.2003 г.
Методом дисков в сочетании с ТСХ и спектрофотометрией проведена сравнительная оценка различных способов фиксации и ферментации лекарственных растений (листья). Использованы виды, синтезирующие алкалоиды различных структурных типов - изохинолина, в числе которых бензо-фенантридины, бисбензилизохинолины, четвертичные протоберберины, апорфины, а также стероидные и дитерпеновые алкалоиды. Выявлены существенные различия в количественном содержании и качественном составе алкалоидов в зависимости от применения тех или иных способов фиксации и ферментации. Установлено, что возникающие при этом различия отражают совокупность трех независимых и в значительной мере разнонаправленных процессов: катаболизма алкалоидов, их взаимопревращения друг в друга и ресинтез за счет первичных предшественников. Воздействуя на перечисленные процессы путем их активации или ингибирования, используя с этой целью различные методы фиксации и ферментации, возможна целенаправленная коррекция алкалоидного комплекса исследованных растений.
Лекарственные растения и получаемые из них фитопрепараты находят широкое и разнообразное применение в медицине и используются для лечения и профилактики практически всех заболеваний человека, в их числе сердечно-сосудистые нарушения, желудочно-кишечные, нервные, кожные и другие болезни различной этиологии и даже злокачественные новообразования [1]. Источниками лекарственного растительного сырья служат либо дикорастущие виды, запасы которых однако истощаются, либо виды, введенные в культуру, но их выращивание достаточно трудоемкий, продолжительный по времени и дорогостоящий процесс. Одним из наиболее перспективных путей повышения потенциала биоресурсов лекарственных растений наряду с новыми прогрессивными технологиями их выращивания является разработка оптимальных режимов фиксации и ферментации исходного лекарственного сырья с целью максимального сохранения в нем основного действующего начала - физиологически активных соединений (ФАС), среди которых важная роль принадлежит алкалоидам. При разработке подобных режимов в ряде случаев возможна целенаправленная коррекция качественного состава этих соединений. Для решения задач такого рода необходима сравнительная оценка
различных способов обработки исходных растений и определение влияния каждого из этих способов на алкалоидный комплекс в целом, в том числе, на суммарное содержание указанных соединений и на их качественный состав в строго контролируемых идентичных условиях. Оптимальное соблюдение этих условий может быть достигнуто с помощью метода дисков, широко используемого в физиологии и биохимии растений при решении различных по сложности задач, обеспечивая высокую гомогенность исходного материала и сводя к минимуму вариабельность полученных результатов [2].
Ранее этот метод был применен нами для изучения алкалоидного комплекса чистотела большого (СНеНйопшт тщш Ь.), люпина многолист-ного (Ьыртш ро1урНу11ш Ь.) и атропы-белладон-ны (А^ора-ЪеЫайоппа Ь.) при различных способах фиксации и ферментации, в том числе, в присутствии мембрано-активных соединений [3]. Однако полученные результаты были недостаточными для обобщающих выводов и для сравнительной оценки влияния различных способов послеуборочной обработки на процессы биосинтеза, метаболизма и катаболического распада алкалоидов, которые при этом имеют место и от которых в значительной мере зависит количест-
венное содержание и качественный состав указанных природных соединений в конечном продукте.
Цель работы - сравнительная оценка различных способов фиксации и ферментации лекарственных растений с алкалоидным типом обмена и разработка теоретических основ оптимизации режимов их послеуборочной обработки, обеспечивающих максимальную сохраняемость алкалоидов.
МЕТОДИКА
В качестве объектов исследования использованы листья следующих видов лекарственных растений: маклея сердцевидная (Macleaya cordata (Wild., R.Br.), барбарис обыкновенный (Berberis vulgaris L.), мачок желтый (Glaucium flavum Crantz.), чемерица Лобеля (Veratrum lobelianum Brenth.) и живокость высокая (Delphinium elatum L.). Перечисленные виды синтезируют алкалоиды различных структурных типов - изохинолины, в числе которых четвертичные бензофенантридины (маклея сердцевидная), бисбензил -изохинолины и четвертичные протоберберины (барбарис обыкновенный) [4], апорфины (мачок желтый), а также стероидные (чемерица Лобеля) и дитерпеновые (живокость высокая) алкалоиды. Все эти виды обладают разнообразной фармакологической активностью - антимикробной, желчегонной, про-тивокашлевой, противопаразитарной и кураре-
Маклея сердцевидная Барбарис обыкновенный Мачок желтый Чемерица Лобеля Живокость высокая
Для обнаружения алкалоидов использовали УФ-лампу и реактив Драгендорфа, который для предотвращения окрашивания фона пластинок силуфола модифицировали прибавлением 0.5-1.0%-ной аскорбиновой кислоты. Идентификацию алкалоидов осуществляли путем сравнения с аутентичными образцами алкалоидов, а также с литературными данными по величине Rf в различных системах растворителей (одномерная и последовательная двумерная ТСХ), методом добавок, с помощью цветных реакций с 12 и УФ-спе-ктрометрии [3, 5, 6].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Полученные данные по количественному содержанию и качественному составу алкалоидов лекарственных растений, подвергнутых различным видам послеуборочной обработки, суммиро-
подобной соответственно, и находят широкое и разнообразное применение в медицинской практике и лекарственном растениеводстве [1].
Из собранных образцов отбирали одинаковые (по возможности) части листьев с учетом их возрастных особенностей и тканевой специфичности. Последнее было необходимо для получения надежных результатов, так как предварительные опыты показали значительные колебания в содержании алкалоидов в зависимости от возраста листьев, а также от того, какую часть листовой поверхности использовали, листовые пластинки или жилки. Диски высекали с помощью сверла (диаметр 14-19 мм). В опыте использовали по 510 дисков, помещая их во флаконы емкостью 20 мл (исключение - варианты с высушиванием); по-вторность (4-10)-кратная. На дисках проводили апробацию различных способов фиксации - высушивание при комнатной температуре, обработка этанолом (погружение) или хлористоводородной кислотой, и различных способов ферментации, в том числе в присутствии мембрано-активных соединений (этанола или толуола) и в их отсутствие. В полученных образцах после перечисленных способов обработки определяли суммарное содержание алкалоидов ранее разработанными методами [5, 6], а также их качественный состав, используя ТСХ на силуфоле в различных системах растворителей:
ваны в таблице и на рисунке. Как и следовало ожидать, универсальных способов, как фиксации, так и ферментации, одинаково пригодных для всех исследованных растений выявлено не было. При этом установлено, что химическое строение индивидуальных алкалоидов как таковых на оптимальные способы и фиксации и ферментации существенного влияния не оказывает. У чемерицы Лобеля (таблица, рисунок, IV ) и живокости высокой (таблица, рисунок, V), например, оптимальный способ фиксации одинаков и состоит в обработке этанолом, хотя оба эти вида синтезируют алкалоиды различных структурных типов -стероидные и дитерпеновые алкалоиды, соответственно. Не обнаружено корреляционной зависимости между строением соединений данного класса, с одной стороны, и наиболее благоприятными условиями ферментации, с другой. Так для барбариса обыкновенного, мачка желтого и житом 40 < 6 2004
толуол-метанол-25%-ный аммиак (20 : 4 : 0.1) толуол-ацетон-метанол-25%-ный аммиак (10 : 10 : 2.5 : 1) толуол-ацетон-метанол-25%-ный аммиак (10 : 10 : 3 : 1) толуол-ацетон-метанол-25%-ный аммиак (10 : 10 : 2 : 0.5) толуол-ацетон-метанол-25%-ный аммиак (10 : 10 : 1.8 : 0.5)
Содержание алкалоидов в дисках лекарственных растений при различных способах фиксации и ферментации (мкг/диск)*
Вид растения Фиксация Ферментация
ФКВ ФКЭ ФКК ФМО ФМЭ ФМТ
Маклея сердцевидная Барбарис обыкновенный Мачок желтый Чемерица Лобеля Живокость высокая 200.00 ± 6.90 13.00 ± 0.56 49.00 ± 1.57 6.80 ± 0.12 8.80 ± 0.11 135.00 ± 4.02 12.80 ± 0.25 50.00 ± 1.55 10.60 ± 0.19 9.80 ± 6.90 180.00 ± 2.98 14.40 ± 0.28 45.00 ± 0.10 4.40 ± 0.05 9.40 ± 0.16 140.00 ± 3.09 10.00 ± 0.20 44.00 ± 0.77 6.00 ± 0.12 12.60 ± 0.33 130.00 ± 2.49 8.60 ± 0.08 43.00 ± 0.43 12.60 ± 0.30 8.80 ± 0.14 125.00 ± 1.47 6.10 ± 0.21 42.00 ± 0.49 11.40 ± 0.22 7.60 ± 0.05
* Примечание к таблице и рисунку: ФКВ - фиксация высушиванием при комнатной температуре; ФКЭ - фиксация погружением в этанол; ФКК - фиксация концентрированной хлористоводородной кислотой; ФМО - ферментация в отсутствие мембрано-активных соединений; ФМЭ - ферментация в присутствии этанола; ФМТ - ферментация в присутствии толуола.
вокости высокой (таблица, рисунок, II, III, IV) оптимальна ферментация в отсутствие мембрано-активных соединений, хотя эти виды, как уже отмечалось, синтезируют алкалоиды, существенно отличающиеся друг от друга по химическому строению.
Установлено, что на процессы и фиксации и ферментации существенное влияние оказывает компартментация алкалоидов in situ, специфика их внутриклеточной и тканевой локализации. Особенно наглядно это прослеживается на примере маклеи сердцевидной, алкалоиды которой первоначально локализованы в специализированных клетках, так называемых идиобластах, содержимое которых к моменту максимального накопления алкалоидов отмирает, а клеточная стенка и прилегающий к ней слой цитоплазмы пропитываетс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.