МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК [536.7:544-971.62:577.323] :577.113.4/. 7
ТЕРМОДИНАМИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ САМОАССОЦИАЦИИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В КОНКАТАМЕРНЫЕ СТРУКТУРЫ ДНК
© 2009 г. Н.С. Филиппов* ** ***, А.А. Ломзов* **, Д.В. Пышный*
*Институт xимической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8;
**Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2;
***Институт физики полупроводников им. А .В. Ржанова СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 13 Поступила в p едакцию 20.10.08 г.
П p оведено систематическое описание схемы равновесного формирования конкатамер ных структур, со стоящих из двух различных олигонуклеотидов. Показано, что в общем случае нельзя найти аналитический вид зависимостей концентраций олигонуклеотидных компонентов системы от температуры, и, как следствие, доказана невозможность определения термодинамических параметров формирования конкатамерных комплексов (AH , AS ) и их температуры плавления из анализа профилей термической денатурации олигонуклеотидных комплексов. Разработан алгор итм численного решения соответствующих неявных зависимостей. Рассмотрен ряд приближений, в случае пр именимости которых возможно упр ощенное описание кривых тер ми-ческой денатур ации конкатамер ных комплексов. Показано, что в случае равенства стабиль-ностей отдельных дуплексных фрагментов конкатамерных комплексов и отсутствия кооперативного взаимодействия в точках одноцепочечного разр ыва возможно аналитическое описание темпер атурной зависимости эффективности комплексообр азования. В этом случае зависимость темпер атуры плавления от тер модинамических параметров и концентр ации олигонуклеотидов имеет такой же вид, как и при фор мир овании дуплексной структуры парой несамокомпле-ментарных олигонуклеотидов. П роведена пр овер ка способности ряда модельных приближений описывать экспериментальные кривые термической денатурации конкатамерных структур. Введена функция, показывающая относительный вклад конкатамера в величину усиления сигнала в зависимости от длины комплекса пр и использовании конкатамер ной структуры в качестве усилителя сигнала гибр идизационных систем анализа ДНК. Опр еделена зависимость максимума этой функции от концентр ации олигонуклеотидов, тер модинамических хар актери-стик формируемых ими комплексов и температуры. C помощью метода задержки в геле показано, что пр едложенная модельная функция распр еделения конкатамеров по длине качественно описывает наблюдаемые экспериментальные зависимости.
Ключевые слова: конкатамерные структуры, ДНК, термодинамика, олигонуклеотиды, самоассоциация.
Конкатамерные комплексы ДНК - линейные полимерные структуры на основе олигонуклеотидов, образующиеся в результате самоассоциации коротких фрагментов ДНК за счет реализации специфических взаимодействий между элементами составной цепи. Образование конкатамерных комплексов становится возможным в случае формирования олигонуклеотида-ми структур, обладающих сродством друг к другу, например, дуплексов с взаимно комплементарными одноцепочечными нависаниями -липкими концами. Такие структуры в последнее вр емя все больше привлекают внимание иссле-
Сокращения: ПААГ - полиакриламидный гель, дцДНК -двухцепочечная ДНК, ДЭГ - диэтиленгликоль.
дователей, занимающихся разработкой препаратов для генной терапии, инструментов для молекулярной биологии и ДНК-диагностики. Установлено, что конкатамеры обеспечивают повышенную эффективность проникновения в эукариотические клетки биологически активных олигонуклеотидных производных [1,2]. Конкатамерные структур ы являются ключевыми объектами при манипуляциях библиотеками рестрикционных фрагментов ДНК [3,4]. Они рассматриваются в качестве перспективных усилителей регистрируемого сигнала при разработке ДНК-диагностических систем, основанных на методе молекулярной гибридизации [5]. Разветвленные двух- или трехмерные аналоги конкатамерных ДНК - ДНК-дендримеры - уже используются как амплификаторы сигнала и
средства повышения эффективности захвата анализируемых нуклеиновых кислот (НК) при гибридизационном анализе [6].
Эффективность использования конкатамер-ных структур во многом зависит от их свойств: тер мической стабильности и длины полимерной цепи, которые определяются гибридизационны-ми свойствами фор мирующих их олигонуклео-тидов (энтальпией (АН0), энтропией (А50) и свободной энергией Гиббса (АО0) комплексо-образования). Практическое использование конкатамер ных стр уктур как компонентов систем анализа ДНК или ср едств внутр иклеточной доставки НК требует проведения предварительного анализа эффективности образования соответствующих ассоциатов для заданных экспериментальных условий. Такой количественный анализ образования конкатамерных стр уктур возможен в рамках модели ближайших соседей для расчета термодинамических характеристик комплексообразования [7,8] составных элементов конкатамерной системы. Однако для этого необходима разр аботка схемы равновесного формирования полимерной структуры, основанного на учете отдельных взаимодействий олигонуклеотидных фр агментов в ее составе. В общем случае, формир ование конкатамера может происходить с участием множества различных олигонуклеотидов, последовательности которых обеспечивают взаимную комплементар-ность структур ных элементов в составе пр оме-жуточных ассоциатов. Теоретически такой полимер может содержать в своей структуре не только одноцепочечные и дуплексные компоненты, но даже триплексные и квадруплексные компоненты [9,10]. На данный момент в литературе представлены модельные описания формирования конкатамерных структур с участием молекул только одного олигонуклеотида [11]. Однако в этом частном случае при использовании протяженных олигомеров, характеризуемых высокой стабильностью формируемых ими дуплексов, резко возрастает вероятность формирования побочных вторичных структур, шпилек, что значительно снижает эффективность полимеризации олигомеров в системе [12]. Этого можно избежать, если конкатамерный комплекс формируется из двух различных олигонуклеотидов, составные части которых взаимно комплементарны, а при взаимодействии олигонуклеотидов образуются комплексы с липкими концами.
Целью данной работы являлось проведение детального анализа особенностей формирования конкатамер ных дуплексов ДНК, формир уе-мых с участием двух различных олигонуклеотидов, направленного на описание их физико-
химических свойств, таких как тер мическая стабильность и характеристический размер. Данная информация необходима для разработки алгоритмов, обеспечивающих возможность проведения рационального дизайна формируемых полимерных ассоциатов на основе данных о стр уктуре составляющих их элементов и условий комплексообразования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Синтез и выделение нативных и «мостико-вых» (несущих вставки на о снове фосфодиэфира диэтиленгликоля) олигонуклеотидов проводили на автоматическом ДНК-синтезаторе ASM-800 (Biosset, Россия) в соответствии с [13]. Гомогенность олигонуклеотидов подтвер ждали с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях (20% полиакриламидный гель (ПААГ), 8 М мочевины, 50 мМ трис-бората (рН 8,3), 0,1 мМ ЭДТА). Концентрацию олигонуклеотидов определяли спектрофотометри-чески, используя суммарные величины оптического поглощения моно- и динуклеотидов (на длине волны 260 нм) [14]. УФ -спектры водных растворов олигонуклеотидов регистрировали с помощью спектрофотометра Shimadzu UV-2100 (Shimadzu, Япония) при 25°С.
Исследование термической денатурации оли-гонуклеотидных дуплексов проводили с использованием двух специализированных приборных комплексов: спектрофотометра Сагу 300 Bio Melt (Varian 1пс., Австралия), оборудованного тер мор егулируемым шестисекционным держателем для кювет (Varian 1пс., Австралия), и установки с терморегулируемой оптической кюветой на базе УФ-детектор а жидкостного хр о-матографа «Милихром» (Научпр ибор, Россия). Регистрацию кривых плавления проводили с пошаговым автоматическим переключением монохроматора в диапазоне длин волн от 240 до 300 нм. Время интегрирования сигнала на каждой длине волны со ставляло 1-2,5 с. Скорость нагрева обр азцов не превышала 2°С/мин. В качестве датчика температуры для прибора «Милихром» использовали медьконстантано-вую термопару, которую подключали к цифровому вольтметру Щ-1516 (Ро ссия). Показания температурного датчика прибора Cary 300 Bio Melt были откалиброваны с использованием термопар ТетрегаШге Probes Series II (Varian 1пс., Австралия).
Суммарная концентрация олигонуклеотид-ных компонентов, взятых в стехиометрическом соотношении, со ставляла от 2 до 100 мкМ. Все образцы олигонуклеотидов готовили на основе буферного р а створ а, содержащего 1 М Nad,
0,01 М фосфата натрия (рН 7,3), 0,1 мМ ЭДТА. Непосредственно перед экспериментом образцы нагревали до 100°С с последующим охлаждением до комнатной температуры.
Определение термодинамических параметров образования бимолекулярных комплексов проводили методом оптимизации кривых плавления в рамках модельного описания равновесной системы.
Величины АН0 и А50 комплексообразования олигонуклеотидов рассчитывали путем минимизации среднеквадратичного отклонения (АА^(Т)2) между экспериментальными значениями оптической плотности, зарегистрированными на длине волны X при температуре Т и рассчитанными на основании используемой модели. Величину АО'Т рассчитывали исходя из полученных величин энтальпии и энтропии ком-плексообр азования: А037 = АН0 - А5 0Т, пр и Т = 310,15 К (37°С).
В процедуре минимизации, в случае стандартных двухкомпонентных комплексов, варьировали шесть параметров, не зависящих от температуры: термодинамические ха рактер и-стики формирования комплекса (АН0, А50) и характеристики оптического поглощения комплекса (наклон и свободный член линейных зависимостей базовых линий одноцепочечного (88) и двухцепочечного (ё8) состояний от темпер атуры) [15]. Оптимизацию проводили с учетом всех экспериментальных точек (400-800 значений оптической плотности) при использовании программы <^шр1ех», разработанной А .В. Ивановым (ИЛФ С О РАН).
Вел
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.