БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.4, c.638-640
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.3
ТЕРМОИНДУЦИР ОВАННОЕ ПРЕВРАЩЕНИЕ а-КРИ СТАЛЛИНА В ТКАНИ ХРУСТАЛИКА ГЛАЗА ПО ДАННЫМ МАЛОУГЛОВОГО
РЕНТГЕНОВСКОГО РАССЕЯНИЯ
© 2009 г. А.В. Кривандин
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануля РАН, 119334, Москва, ул. Косыгина, 4
Поступила в p едакцию 08.12.08 г.
Методом малоуглового рентгеновского pассеяния исследованы термоиндуцированные структурные превращения кристаллинов в хрусталике глаза. Показано, что кратковременная инкубация ткани хрусталика глаза быка (~ 1 мин) при температуре около 60°C приводит к выраженному смещению малоуглового дифракционного максимума, обусловленного ближним порядком олигомеров а-кристаллина. Результаты свидетельствуют о том, что в нативном окружении и пр и нативной концентр ации происходит термоиндуцированная перестр ойка четвертичной структур ы а-кристаллина, в результате которой молекулярная масса олигомер ов а-кристаллина возр астает. Такое тер моиндуцированное превращение а-кристаллина наблюдалось раньше в растворах и гелях этого белка. Полученные результаты подтверждают идентичность свойств а-кристаллина in vitro и in vivo.
Ключевые слова: а-кристаллин, четвертичная структура, термоиндуцированное превращение, малоугловое рентгеновское рассеяние.
а-К р исталлин является одним из о сновных стр уктурных белков хрусталика глаза. Это оли-гомерный белок со ср едней молекулярной массой около 700 кДа, состоящий из нековалентно связанных субъединиц с молекулярной массой около 20 кДа каждая [1]. Подобно малым белкам теплового шока а-кристаллин эффективно препятствует агрегации белков с дестабилизированной структурой (шапероноподобная активность а-кристаллина) и, как считается, таким образом поддерживает прозрачность хрусталика на протяжении жизни [1]. Исследования, пр оведенные на растворах и гелях а-кр и-сталлина, показали, что при температуре выше 50°С пр оисходит необр атимая перестройка чет-вер тичной структуры этого белка, в результате которой размер и молекулярная масса его олигомеров увеличиваются [2-4] (молекулярная масса а-кристаллина после инкубации при 60°С увеличивалась в ~2 раза [4]). Однако при исследовании влияния нагревания на структуру кристаллинов в целом хрусталике, результаты, свидетельствующие о перестройке четвертичной структуры а-кристаллина, получены не были [3]. Эта работа выполнена с целью выяснения вопр оса о том, происходит ли термоиндуциро-ванная перестройка четвертичной структуры а-кристаллина в ткани хрусталика, т.е. при на-тивной концентрации и в нативном окружении.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование ткани хрусталиков проводили методом малоуглового рентгеновского рассеяния, как в работах [5,6]. Использовали хрусталики глаза быка (возр аст около 1 года). Участки внешней части (кортекса) хрусталика помещали в герметично закрытую латунную кювету с окнами для р ентгеновского пучка из тонкой полимерной пленки и исследовали при комнатной температуре на малоугловом рентгеновском ди-фрактометре [6] с координатным детектором [7] в исходном (нативном) со стоянии и после инкубации в водяном термостате при температуре от 50 до 65°С. Температуру образцов контролировали при помощи термопары, прикрепленной к кор пусу кюветы. Время нагревания образцов до заданной температуры составляло ~1 мин. Использовалась щелевая коллимация рентгеновского пучка, сфокусированного одним зеркалом. Интенсивность рассеяния умножали на коэффициент поглощения рентгеновского излучения образцом, вычитали интенсивность фонового рассеяния, измеренного с пустой кюветой, и вводили коллимационную поправку по методу [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Дифрактограммы нативной ткани хрусталика (до нагревания), как и в [6], содержали
ТЕРМОИНДУЦИРОВАННОЕ П РЕВРАЩЕНИЕ а-КРИ С ТАЛЛИНА 639
широкий дифракционный максимум (рисунок, кр ивая 1) с центр ом пр и 5 = 28т0/к - 0,052 нм-1 (к = 0,154 нм - длина волны рентгеновского излучения СиКа, 20 - угол рассеяния), который соответствует брэгговскому расстоянию В = 1/5 - 19 нм. Этот максимум обусловлен ближним пор ядком олигомер ов а-кр исталлина в хрусталике [9]. Значение В примерно соответствует среднему расстоянию между центрами со седних олигомер ов а-кр исталлина в хрусталике. Считая, что олигомер ы а-кр исталлина р а спр еделены в объеме равномер но и расстояние а между центр ами ближайших олигомер ов пр имер но одинаковое (геометр ия гексагональной плотной упаковки), получаем, что пр и В -2
19 нм а = ~г=В - 21,9 нм. Расстояние а можно
<33
р а ссчитать для такого распр еделения олигоме-ров а-кристаллина, зная молярную массу а-кристаллина М и его концентрацию в хрусталике С. Гр авиметр ические измер ения нативной и высушенной ткани хрусталика показывают, что концентр ация в сех кр исталлинов во внешней части хрусталика глаза быка равна ~0,3 г/см3. Содержание а-кристаллина в кортексе хр усталика глаза быка со ставляет ~50% от массы всех кристаллинов [10] и, следовательно, концентр ация а-кр исталлина С - 0,15 г/см3. Используя это значение С и М - 700000 г/моль
'4 М
[1], получаем: а
3 СИ
А
число Авогадро). Это значение совпадает со значением а, определенным на основании экспериментально найденного значения В = 19 нм, что подтверждает адекватность модели ближнего порядка олигомер ов а-кр исталлина в хрусталике.
Непродолжительная инкубация ткани хрусталика пр и темпер атур е около 60°С пр иводит к смещению дифр акционного максимума в сторону меньших значений 5. Как показано на рисунке (кривые 2, 3), после инкубации в течение 1 мин пр и 58°С максимум сместился до 5 - 0,043 нм-1 (В - 24 нм), а по сле инкубации пр и 60°С - до 5 - 0,033 нм-1 (В - 30 нм). П р и увеличении температуры и/или продолжительно сти инкубации дифр акционный максимум в до ступной для регистр ации области дифр акционного поля быстр о пр опадает. Для пример а на рисунке приведена дифрактограмма, полученная после инкубации пр и темпер атур е 65°С в течение 10 мин (кривая 4, интенсивность уменьшена в тр и р аза).
= 21,7 нм (ИА -
Малоугловые дифр актогр аммы кор текса хр усталика глаза быка: 1 - исходное (нативное) со стояние; 2 - после инкубации 1 мин пр и 58°С; 3 - после инкубации 1 мин пр и 60°С; 4 - после инкубации 10 мин пр и 65°С (интенсивность уменьшена в тр и раза).
П р исутствие максимума на дифр актогр амме ткани хрусталика после нагревания (рисунок, кривые 2, 3) свидетельствует о со хр анении ближнего порядка олигомер ов а-кр исталлина и о том, что эти олигомер ы по сле нагр евания остаются достаточно близкими по размеру. С мещение максимума в стор ону меньших зна -чений 5 и увеличение его интенсивно сти свидетельствует об уменьшении числа олигомеров а-кристаллина в единице объема и об увеличении их молекуляр ной массы, т .е. о тер моин-дуцир ованной пер естр ойке четвер тичной струк -туры а-кристаллина в ткани хрусталика, аналогичной той, что наблюдалась раньше в раствор ах и гелях этого белка [2-4].
Число олигомер ов а-кр исталлина в единице объема пр опор ционально В-3. Поэтому смещению максимума от ~19 нм до ~24 нм соответствует уменьшение числа олигомер ов в единице объема в ~2 раза, а смещению от ~19 нм до ~30 нм - в ~4 раза. Молекуляр ная масса олигомер ов а-кр и сталлина пр и этом может увеличиваться в меньшей степени (не в два - четыр е р аза), если учесть, что содержание олигомер ов в единице объема может уменьшаться также за счет образования комплексов а-кристаллина с дестабилизир ованными нагр еванием в- и у-кр и-сталлинами.
Дифрактограммам без дифракционного максимума, которые наблюдаются после более интенсивного теплового воздействия (рисунок, кривая 4), по-видимому, соответствует со стояние, когда о сновная часть а-кр исталлина обр азовала комплексы с дестабилизир ованными
640
К РИВАНДИН
нагр еванием в- и у-кристаллинами. Каждый из таких комплексов содержит несколько олиго-меров а-кристаллина, ближний пор ядок олиго-меров внутри комплексов не наблюдается [4]. Похожая дифр актограмма нативной ткани хр у-сталика глаза быка, не содержащая малоугловых максимумов, была получена в работе [5]. Это свидетельствует о том, что в хрусталике in vivo также могут протекать процессы структурной перестройки и комплексообразования кристаллинов, приводящие к исчезновению ближнего порядка олигомеров а-кристаллина.
Авторам работы [3] не удалось зарегистрировать смещение малоуглового максимума на дифрактограмме хрусталика при нагревании, которое могло бы свидетельствовать о тер мо-индуцированной перестройке четвертичной структуры а-кристаллина в нативном окружении. По-видимому, основной причиной этого является то, что при использованном в работе [3] режиме инкубации 50°C, 10 мин структурная перестройка а-кристаллина была выражена слишком слабо, а режим инкубации 60°C, 10 мин приводил к интенсивному процессу ком-плексообразования а-кристаллина с другими кристаллинами и исчезновению в результате этого дифракционного максимума.
П р едставленные в этом сообщении данные о термоиндуцированной перестройке четвертичной структуры а-кристаллина в ткани хрусталика свидетельствуют о сходстве структурно-функциональных свойств а-кристаллина in vitro и in vivo. Результаты некоторых работ [2,11] показывают, что шапероноподобная актив-
ность а-кристаллина в pезультате его термо-индуцированных превращений возрастает. Не исключено, что похожие структурные превращения а-кристаллина могут происходить in vivo и их функциональный смысл заключается в увеличении шапероноподобной активности а-кристаллина при тепловом шоке.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (пр оект № 08-04-01787).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. J. Horwitz, Ехр. Eye Res. 76, 145 (2003).
2. M. R. Burgio, P. M. Bennett, and J. F. Koretz, Modular Vision 7, 228 (2001).
3. J. W. Regini, J. G. Grossmann, M. R. Burgio, et al., J. Mol. Biol. 336, 1185 (2004).
4. А. В. К р ивандин, К. О. Мур анов и М. А. Островский, Молекуляр. биология 38 (3), 532 (2004).
5. А. В. Кривандин и Л. А. Фейгин, Биофизика 35 (3), 461 (1990).
6. А. В. Кривандин, Биофизика 42 (6), 1274 (1997).
7. С. Е. Ва сильев, Д. Е. Доне
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.