ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 46, № 4, с. 422-427
УДК 577.325:577.112
ТЕРМИЧЕСКАЯ ИНАКТИВАЦИЯ СВОБОДНОЙ И ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ИНУЛИНАЗЫ
© 2010 г. В. Г. Артюхов, Т. А. Ковалёва, М. Г. Холявка, Л. А. Битюцкая, М. В. Гречкина
Воронежский государственный университет, Воронеж, 394006 e-mail: Tamara_Kovaleva@inbox.ru Поступила в редакцию 11.01.2009 г.
Исследован процесс термической инактивации инулиназы из Kluyveromyces marxianus Y-303 в свободном состоянии и после адсорбционной иммобилизации на катионообменном волокне ВИОН КН-1. Методом атомно-силовой микроскопии выявлено, что данный фермент имеет олигомерную структуру и состоит из 2 различных по размеру субъединиц. При 60°С, вероятно, происходит разрушение межсубъединичных контактов и диссоциация молекулы инулиназы на 2 мономера, располагающиеся отдельно друг от друга.
В настоящее время при усовершенствовании многих технологических процессов производства фармацевтических препаратов и продуктов функционального питания широко используются гидролитические ферменты в свободном и иммобилизованном состояниях. Одним из перспективных продуктов функционального питания является фруктоза, которая обладает низкой калорийностью и в настоящее время превратилась в популярный заменитель сахара. Фруктозу, в отличие от глюкозы, могут потреблять больные диабетом, она значительно менее вредна для зубов, чем сахар.
Промышленное производство фруктозы ферментативным путем состоит из нескольких этапов и требует наличия 3 различных ферментов — а-амила-зы, глюкоамилазы и глюкозоизомеразы. При этом из крахмала получают 45%-ный фруктозный сироп. В случае применения инулиназы (КФ 3.2.1.7) для расщепления инулинсодержащего сырья в одностадийном процессе получают конечный продукт — 95%-ный фруктозный сироп. Другой путь использования этого фермента — прямая ферментация инулина в этанол путем сбраживания сока топинамбура с помощью Zymomonas mobilis [1, 2] или сока георгина с помощью Clostridiumpasterianum [3].
Однако возможности применения ферментов ограничены по ряду причин: трудоемкость получения гомогенных фракций, их неустойчивость при различных, особенно тепловых, воздействиях, невозможность многократного использования из-за сложности отделения ферментов от реагентов и продуктов реакции. Преодоление этих затруднений связано с получением иммобилизованных препаратов белковых макромолекул.
Иммобилизация — один из путей повышения стабильности ферментов по отношению к денату-
рирующим факторам внешней среды. Она способствует применению биокатализаторов в фармацевтической, пищевой промышленности, а также в аналитической практике. Гетерогенные белковые образцы можно рассматривать, как весьма реальные модели биологически активных систем, действующих in vivo внутри мембран или на их поверхности.
В ряде работ показано, что дрожжи Kluyveromyces marxianus являются очень перспективными продуцентами инулиназы. Встречаются публикации по иммобилизации данного фермента и целых клеток дрожжей на различных носителях [4—10].
Цель работы — изучение процесса термоинактивации свободной и иммобилизованной на катионообменном волокне ВИОН КН-1 инулиназы из K. marxianus.
МЕТОДИКА
Объект исследования — фермент инулиназа (КФ 3.2.1.7), выделенная из дрожжей Kluyveromyces marxianus Y-303 (Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов, Москва). Глубинное культивирование продуцента проводили в колбах емкостью 500 мл, содержащих по 50 мл питательной среды, в течение 72 ч на лабораторной роторной качалке WS-2 производства "Varimex" (Польша). Биомассу продуцента отделяли путем центрифугирования при 250 g в течение 10 мин. Из полученного осадка фермент экстрагировали путем добавления 4-кратного количества дистиллированной воды.
Далее фермент осаждали 80%-ным изопропило-вым спиртом в соотношении 1 объем дрожжевого экстракта к 4 объемам изопропанола и центрифугировали при 1200 g в течение 15 мин. Полученный
%
120
100 -
80
60
40
20
0 20
40
60
80
100 °C
Рис. 1. Зависимость каталитической активности (%) свободной (1) и иммобилизованной на ВИОН КН-1 (2) инулиназы от температуры.
осадок растворяли в минимальном объеме ацетатного буфера, рН 4.7. Дальнейшую очистку фермента проводили методом гель-хроматографии на сефа-дексе G-150 фирмы "Pharmacia" (Швеция). Гомогенность полученных препаратов контролировали методом электрофореза в полиакриламидном геле.
В качестве носителя использовали катионооб-менное волокно ВИОН КН-1 опытного производства Института физической и органической химии НАН Белоруссии. Подготовку ионита к иммобилизации осуществляли путем 4-кратной кислотно-щелочной обработки и перевода его в H-форму [11, 12]. Для проведения сорбционной иммобилизации 5 г носителя оставляли на ночь при комнатной температуре в 50 мл ацетатного буфера, рН 4.5. К суспензии волокна добавляли 5 мл раствора фермента и перемешивали в колбе с помощью электрической мешалки типа ММ-6 (Польша) в течение 1.5 ч при 25°С, далее центрифугировали 5 мин при 1200 g. Осадок промывали ацетатным буфером, рН 4.5, до отсутствия белка в промывных водах.
Содержание белка в опытах со свободным ферментом определяли методом Лоури, для иммобилизованной инулиназы использовали модифицированный метод Лоури. Сущность модификации заключалась в том, что на первом этапе анализа осуществляли разрушение связей между матрицей носителя и молекулой фермента. Для этого обрабатывали иммобилизованный препарат раствором К,№-тартрата, приготовленном на 1 М NaOH при 50°С в течение 10 мин.
Каталитическую активность инулиназы измеряли спектрофотометрическим методом на фотоэлек-троколориметре КФК-3 (Россия) [13]. В качестве
субстрата использовали инулин фирмы "MP biomedicals" (Германия). Реакцию гидролиза инулина осуществляли на установке, состоящей из термостата UTU-4 "Horyzont" (Польша), соединенного с 2 ферментерами, помещенными на магнитную мешалку. В одном ферментере проводили инкубацию инулиназы с субстратом в течение 20 мин при рН 4.7 и 50°С, в другом — вместо раствора фермента помещали такое же количество ацетатного буфера. Анализ каталитической способности иммобилизованного препарата проводили при рН 4.5 и 70°С.
Процесс термической инактивации инулиназы исследовали методом дифферециального термического анализа (ДТА). Скорость нагревания образцов 1°С/мин, шаг считывания данных составлял 1 с. В качестве материала термопар выбраны медь и медь-константановый сплав.
Визуализацию олигомерной структуры инулина-зы К. marxianus осуществляли методом атомно-си-ловой микроскопии. Изображение поверхности молекулы фермента и его субъединиц получали в лаборатории наноскопии и нанотехнологии ЦКПНО Воронежского государственного университета на сканирующем зондовом микроскопе SOLVER P47PRO фирмы "НТ-МДТ" (Россия, Зеленоград). Чтобы приготовить белковые образцы для атомно-силовой микроскопии, пластинки свежесколотой слюды (1.5 х 1.5 см) в течение 5 мин инкубировали с 5 мл буферного раствора фермента, рН 4.7, высушивали полученные препараты в эксикаторе с влажностью 5-10%.
При статистической обработке результатов экспериментов достоверность отличий контрольных и экспериментальных образцов оценивали с помощью i-критерия Стьюдента при уровне значимости 5%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В работе использовали препарат инулиназы с 17.9-кратной степенью чистоты и 2%-ным выходом. Электрофорез в полиакриламидном геле показал гомогенность полученных образцов. Подробная схема и протокол очистки инулиназы К. шатапт представлены в работе [14].
Обнаружено, что инулиназа К. шатапт имеет оптимум активности при 50°С, при 70°С сохраняется 20% ее каталитической способности (рис. 1). Анализируя данные различных авторов, можно отметить, что для большинства инулиназ каталитический оптимум находится в диапазоне 45—55°С, а для некоторых он соответствует 57 и даже 60°С [15]. Показано, что дрожжи К. шатапш проявляли максимальную инулиназную активность при 55°С и рН 5.0 [16]. По другим литературным источникам максимальный гидролиз инулина инулиназой из К.шаЫапш происходил при 45°С, активность фер-
424
АРТЮХОВ и др.
%
мин
Рис. 2. Зависимость каталитической активности (%) инулиназы от времени термической инактивации: 1 -40, 2 - 50, 3 - 60, 4 - 70, 5 - 80°С.
мента при 30-35°С была вдвое ниже, чем при 45-50°С, и резко падала при 60-70°С [17].
При адсорбции на катионообменном волокне ВИОН КН-1 препарат инулиназы обладал 27.5% первоначальной активности. Для иммобилизованной инулиназы оптимум функционирования смещался в сторону более высоких температур и составлял 70°С.
С целью изучения воздействия различных температур на конформацию макромолекулы инулиназы К. татапш нами были проведены эксперименты по исследованию термостабильности данного препарата. Для этого раствор белка инкубировали в интервале времени 10-60 мин при различных температурах с последующим определением каталитической активности. На рис. 2 отражена динамика процесса инактивации инулиназы К. татапш. За 100% принята максимальная ферментативная активность нативной инулиназы без какой-либо предварительной инкубации, наблюдаемой нами при 50°С, рН 4.7.
Показано [17], что инкубация инулиназы из К. татапш при температурах от 30 до 37°С в физиологическом растворе в отсутствие субстрата не подавляла ее каталитической способности, однако при 45°С терялось 25-30% ферментативной активности. Воздействие более высоких температур на фермент приводило к его резкой инактивации. По нашим данным, термомодификация инулиназы начиналась уже через 10 мин инкубации фермента в буферном растворе при 40° С, через 60 мин оставалось 42% первоначальной активности. При 50°С процесс инактивации происходил интенсивнее и через 60 мин инкубации сохранялось лишь 33% каталитической способности.
ДТ
Рис. 3. Кривая дифференциального термического анализа процесса плавления инулиназы.
Следует отметить, что кривые термопревращения инулиназы при 60-80°С имеют 2 участка: первый (время инкубирования менее 10 мин) отличается высокой скоростью падения каталитической способности. Для второго (время инкубирования от 20 до 60 мин) характерна стабилиз
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.