ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ БИОЛОГИИ, 2011, том 72, № 2, с. 140-149
УДК 582.282
ТЕРМОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ У ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE
© 2011 г. В.А. Калюжин
НИИ биологии и биофизики при Томском государственном университете 634050, Томск, пр. Ленина, 36 e-mail: Kalyuzhina@obr.admin.tomsk.ru Поступила в редакцию 16.08.2010 г.
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae в природных условиях в основном размножаются на поверхности твердого или жидкого субстрата. На жизненный цикл таких популяций оказывает существенное влияние суточное изменение температуры. Экспериментально установлена закономерность ответной реакции нелимитированной культуры дрожжей S. cerevisiae на изменение температуры культивирования, заключающаяся в том, что при смене температуры культивирования от диапазона (12-36) °С к диапазону (37.5-40) °С и при отсутствии внешних ограничений на функционирование хемиос-мотической биоэнергетической системы клетки популяция дрожжей проявляет свойство терморезистентности, позволяющее популяции в переходных условиях в течение 1-4 периодов удвоения численности клеток сохранять скорость генерации в 1.5-2 раза выше, чем в стационарных условиях, что обусловлено адаптивной активностью хемиосмотической системы клетки, приобретенной в процессе эволюции, причем после исчерпания адаптивных ресурсов свойство терморезистентности у популяции дрожжей полностью восстанавливается при температуре 12-36 °С в течение одного поколения как в нелимитированных, так и в лимитированных по источникам питания условиях. Адаптивное значение такой терморезистентности очевидно: она позволяет дрожжам сохранять высокую скорость размножения при кратковременном послеполуденном максимуме температуры.
Природные популяции микроорганизмов растут и развиваются в переменных условиях. В процессе их жизнедеятельности изменяется рН среды, концентрация веществ, содержание кислорода. Одним из постоянно действующих факторов является суточный ход температуры. В летнее время ночью температура достигает минимального значения, а в послеполуденные часы - максимального. Изучаемый вид дрожжей встречается в природных условиях (Наумов, Никоненко, 1988, 1991; Наумов и др., 2006; Юрков, 2005). Их ограниченная распространенность, очевидно, обусловлена тем, что для роста и размножения дрожжам необходимы как простые сахара, так и источники азота, калия, фосфора, магния и главное - фактор роста й-биотин. По этой причине оптимальной средой обитания для данного вида дрожжей является поверхность поврежденных плодов и ягод, нектарники цветов, места истечения соков растений (Наумов, Никоненко, 1988). Здесь они могут быть обеспечены кислородом, усвояемыми углеводами, источниками азота, калия, фосфора, магния и витаминами растительного происхождения. Именно поэтому сахаромицеты в природных условиях наиболее активно растут и размножаются на открытой по-
верхности, и по этой причине на их жизненный цикл оказывает существенное влияние суточное изменение температуры (Кудрявцев, 1954; Бер-ри, 1985; Бабьева, Чернов, 1992). Температура открытых поверхностей при прямом солнечном освещении обычно на 10-25 °С выше, чем температура окружающего воздуха. В тени превышение температуры составляет 4-7 °С (Краткий справочник..., 1973; Тенси, Брок, 1981). При этом оптимальная температура у данного вида дрожжей составляет 30-33 °С. Таким образом, в летний период в обширном поле географических широт дрожжи постоянно подвергаются воздействию супраоптимальной температуры в дневное время, а ночью температура понижается, достигая субоптимального уровня. Можно предположить, что в процессе эволюции у представителей этой группы микроорганизмов выработались механизмы, сглаживающие влияние изменения температуры среды обитания.
Цель проделанной работы: изучение адаптации дрожжей к меняющемуся температурному режиму; исследование влияния трофических факторов и факторов ингибиторов на адаптацию дрожжей к температурному режиму; выявление возмож-
ности управления ростом дрожжей при помощи температурного фактора.
Объектом исследования выбраны дрожжи Басскаготусез сегеугзгае. Опыты проводили с коллекционным штаммом дрожжей, выданным из ВНИИ хлебопекарной промышленности Санкт-Петербурга (раса 14). Выбор объекта исследований был обусловлен следующими причинами: промышленное выращивание дрожжей относится к одному из наиболее крупнотоннажных биотехнологических производств; поскольку дрожжи играют существенную роль в практической деятельности человека, то необходимо добиться управляемости процесса их выращивания.
В данной работе рассматривается возможность управления таким показателем, как скорость размножения при помощи температурного фактора. При этом изучаются генетически закрепленные адаптивные возможности дрожжей, приобретенные ими в процессе эволюции. Причем изучали адаптивные возможности в условиях, где температурный режим изменялся с интенсивностью, намного превышающей интенсивность природных процессов. Иначе говоря, в условиях, обеспечивающих оперативное управление скоростью размножения культуры.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Изучали турбидостатную культуру дрожжей Б. сегеугзгае-14. Дрожжи росли на синтетической питательной среде. Один литр среды при насыщающей концентрации содержал глюкозы 4 г, (Ш4)2804 - 1 г, К2804 - 1 г, MgSO4 - 0.2 г, №Н2РО4 - 0.2 г, в-аланин - 1 мг, дестиобитина -1 мг. Концентрация компонентов среды более чем в 5 раз превышала минимально насыщающую. Среду готовили на водопроводной воде. Цитрат-ным буфером устанавливали концентрацию ионов водорода с рН 4. Концентрация сырой биомассы составляла 0.5 г/л.
В другой серии опытов среда была лимитирована одним из перечисленных компонентов. Цитратный буфер поддерживал рН 4. Содержание цитрата составляло 2 г/л. Выбор буфера обусловлен тем, что цитрат не усваивается данным видом дрожжей (Кудрявцев, 1954; Ленинджер, 1974), а проведение опытов в условиях лимитирования источником фосфора исключает возможность применения фосфатного буфера. Обеспечивалась глубинная аэрация с подачей 600 л воздуха в час на 1 л среды. Точность поддержания оптической плотности составляла ±0.3%. Рабочий объем ферментера 75 мл. Подачу свежей среды осуществ-
ляли порционно при достижении уровня сигнала рассогласования 0.3% между рабочим фотосопротивлением и эталонным сопротивлением. Концентрацию клеток определяли прямым многократным подсчетом в камере Горяева. Интервалы между замерами составляли 0.5 ч. Подсчет вели в условиях, исключающих размножение дрожжей. Слежение за скоростью протока вели непрерывно.
Показатели, необходимые для оценки динамики размножения дрожжей в переходных условиях, определяли расчетным путем. Так, среднее значение удельной скорости роста в интервалах между замерами рассчитывали по формуле (Лирова, 1980)
1п х 1 - 1п X 0
В,
(1)
t 1 - t0
где ц(ч-1) - среднее значение удельной скорости роста в интервале времени 1Х - t0, х1 - концентрация клеток в момент измерения, х0 - концентрация клеток при предыдущем замере, - 10 - интервал времени в часах между замерами, В (ч-1) - скорость протока.
Рассчитанные значения ц позволяют определить длительность генеративного цикла по формуле
1п 2
П
(2)
где g (ч) - длительность генеративного цикла.
Рассчитанные значения позволяют определить число генераций в произвольном интервале времени. Поскольку в данной работе отслеживалась дифференцированная динамика переходного процесса, то рассчитывали доли генеративного цикла за период времени меньший, чем длительность генеративного цикла. Расчеты проводили по формуле
t 1 - t 0
t 1 - t 0
(3)
1п2/п g
где Дg - доля генеративного цикла за интервал времени 11 - t0.
Последовательное суммирование долевых величин Дg, осуществляющихся за интервал времени t1 - t0, позволяет рассчитывать продолжительность генеративного цикла. Схема опытов была следующей. Дрожжи в течение 12 поколений выращивали в турбидостате при фиксированной температуре t Затем за 4 мин темпера-
,о
тура изменялась до t ° и поддерживалась в течение 12 поколений. После смены температуры
Таблица 1. Длительность генеративного цикла у дрожжей при стационарном культивировании
Температура культивирования, °С Время генерации клеток (время удвоения числа клеток), ч Удельная скорость роста, ц, ч-1
14 8.7±0.27 0.08±0.01
20 5±0.1 0.14±0.003
25 3±0.1 0.23±0.005
30 2.3±0.04 0.3±0.0075
33 2.2±0.04 0.32±0.005
36 3±0.1 0.14±0.005
37.5 5±0.1 0.14±0.005
39 9.9±0.7 0.07±0.005
Таблица 2. Длительность генеративного цикла у дрожжей при повышении температуры
Темпера- Время генерации клеток
турный (время удвоения числа клеток) при t1, ч
переход
10 — 10 11 —> «2 I II III IV
14—^20 4.75±0.5 5±0.2 5±0.1 5±0.1
20—25 3.2±0.35 3.1±0.12 3±0.1 3±0.1
25—30 2.3±0.08 2.3±0.06 2.3±0.04 2.3±0.04
30—36 3±0.1 2.5±0.2 2.8±0.2 3±0.1
30—37.5 2.5±0.2 2.6±0.2 2.6±0.2 2.7±0.3
30—39 2.7±0.2 3.2±0.3 3.6±0.4 3.8±0.5
30—40 4.2±0.8 Остановка размножения
дрожжей
14—30 2.4±0.1 2.3±0.15 2.3±0.1 2.3±0.08
20—30 2.4±0.2 2.3±0.15 2.3±0.1 2.3+0.06
14—39 3.3±0.3 2.7±0.3 2.8±0.4 3.5±0.8
20—37.5 2.6±0.12 2.7±0.14 2.8±0.2 3.5±0.6
начинался переходный процесс. Температурный режим поддерживали при помощи водяного ультратермостата с точностью ±0.1°. Водяная рубашка окружала весь объем ферментера. Изменение температуры достигалось переключением на другой термостат. Изучали один из наиболее важных показателей - длительность генерации, т.е. время, необходимое для удвоения числа клеток. Доверительные интервалы рассчитывали на основе критерия Стьюдента на уровне р = 0.05 (Лакин, 1980).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Предварительно были определены температурные границы, в пределах которых возможен рост и размножение дрожжей. Было установлено, что нижняя граница составляет 3-5 °С , а верх-
няя 40 °С (Калюжин и др., 1985). При температуре 30-33 °С отмечается наибольшая скорость размножения дрожжей. В связи с этим 30-33 °С были определены как оптимальная температура. В свою очередь область ниже 30 °С является областью субоптимальных температур, а выше 33 °С - супраоптимальной (табл. 1).
В первой серии опытов изучали культуру, растущую при стационарны
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.