УДК 577.352;581.1.03
ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ МЕМБРАН И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА (мБТШ) ПРИ ДЕЙСТВИИ НА РАСТЕНИЯ ПОВЫШЕННЫХ ТЕМПЕРАТУР
И ВОДНОГО ДЕФИЦИТА © 2015 г. Л. П. Хохлова*, Р. Н. Валиуллина, Д. Р. Мидер, Н. И. Акберова
Институт фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета,
420008, Казань, ул. Кремлевская, 18; *электронная почта: hohlova.ludmila2011@mail.ru Поступила в редакцию 05.06.2014 г.
Изучали температурную зависимость проницаемости клеточных мембран при 49—57°С, регистрируя кондуктометрическим методом экзоосмос электролитов из интактных тканей листьев 7-суточ-ных проростков трех сортов яровой пшеницы (ТпНсит ав5(пит Ь.), выращенных при разных режимах теплового шока (ТШ) и засухи. После 5-минутного нагревания образцов при заданных температурах были определены кинетические параметры термостабильности мембран — температура порогового повреждения мембран (ТППМ), угол наклона температурных кривых и коэффициенты повреждаемости мембран (КП), характеризующие амплитуду и скорость их термотропных переходов. Обнаружены сортоспецифические различия этих параметров, что позволило провести распределение исследуемых сортов пшеницы по степени теплоустойчивости. Экспрессию генов мБТШ16.9В и мБТШ17.3 изучали методами ОТ-ПЦР и нозерн-блот-гибридизации по содержанию транскриптов мРНК. Установлена слабая конститутивная экспрессия генов в норме. Однако в стрессовых условиях (при комбинированном действии ТШ с предшествующей термоадаптацией или засухой) обнаружено повышение транскрипции, особенно гена мБТШ17.3, что указывает на регуляцию стрессом активности этих генов. Более четкие различия между контрастными по теплоустойчивости сортами выявлены при анализе транскриптов мБТШ17.3. В условиях стресса уровень транскриптов этого гена у растений высокоустойчивого сорта с повышенной термостабильностью мембран был выше, чем у менее устойчивых. Эти результаты свидетельствуют о сортоспецифической зависимости активности гена мБТШ17.3 и о прямой корреляции между термостабильностью мембран, выносливостью растений к гипертермии и транскрипцией гена мБТШ17.3. Предполагается, что индукция синтеза и накопление мБТШ17.3 обеспечивает более высокую термостабильность мембран в результате их ассоциации с данным белком, предотвращая флюидизацию (растекание) и дезинтеграцию липидного бислоя при высокотемпературном стрессе и водном дефиците.
Ключевые слова: ТпНсит ав5(пит, гипертермия, водный дефицит, мембраны, мБТШ, термостабильность, экспрессия генов.
Б01: 10.7868/80233475515010065
ВВЕДЕНИЕ
Устойчивость растений к тепловому и водному стрессам связана со множеством физиологических, биохимических и молекулярно-генетиче-ских изменений, включая модификацию физических свойств мембран и индукцию генов стрессовых белков [1—3]. Представление о биомембранах как о системах, чувствительных к абиотическим и биотическим факторам [4], определило интерес к изучению термостабильности мембран, выражающейся в повышенной стойкости и лучшем сохранении их структурной целостности в условиях стресса. Была установлена прямая корреляция
между термостабильностью мембран (тестируемой по выходу электролитов из тканей) и выносливостью растений разных видов к тепловому шоку (ТШ) [3]. Наряду с термостабильностью мембран важной составляющей ответов растений на действие повышенных температур и водного дефицита является экспрессия генов и синтез белков теплового шока (БТШ). Во многих работах констатируется зависимость термовыносливости растений от индукции БТШ [1, 3, 5]. Необычность растений состоит в экспрессии множества семейств низкомолекулярных БТШ (мБТШ) с мол. массой 15—40 кДа. Разнообразие мБТШ в растительных клетках, ярко выраженные
шаперонная активность, конформационный динамизм, высокая степень гидрофильности, локализация почти во всех клеточных структурах, участие в передаче сигналов — все эти свойства определяют многофункциональность белков данного класса и признаются решающими для защиты растительных клеток от эффектов теплового воздействия [6—9]. Однако данные о функционировании мБТШ в качестве протекторов и стабилизаторов мембран растений в условиях стресса немногочисленны. Вместе с тем высокий уровень и полиморфизм мБТШ в мембранах митохондрий и хлоропластов предполагает вовлечение этих белков в предотвращение вредного влияния нагревания и водного дефицита на энерготрансфор-мирующие мембраны [10—12].
Известно, что в природных условиях высокие температуры и засуха обычно действуют сопряженно. Показано, что ТШ вызывает повышение устойчивости растений не только к перегреву, но и к действию засухи, и это свидетельствует о функционировании общих систем устойчивости [13]. Более того, слабый ТШ (37—40°С) способствует развитию приобретенной или индуцированной термотолерантности к последующему действию "жесткого" теплового режима (50°С) [1, 2, 14].
К настоящему времени явно ощущается недостаток сведений о влиянии комбинированного действия ТШ и водного дефицита на мембранные и молекулярно-генетические механизмы у растений одного вида, но обладающих различной устойчивостью. Такие сведения необходимы, во-первых, для понимания многофакторной природы регуляции выносливости растений к неблагоприятным условиям среды и, во-вторых, для поиска и идентификации мембранных и молекулярных маркеров устойчивости растений, в которых нуждается сельскохозяйственная практика.
Цель работы заключалась в выяснении зависимости термостабильности мембран от экспрессии генов мБТШ у растений разных сортов при гипертермии и водном дефиците.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования являлись листья 7-су-точных проростков трех сортов мягкой яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) отечественной селекции — Омская 33 (СиБНИИСХ), Дебют и За-камская (Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства, Татарстан), отличающихся по морфотипу и продуктивности [15].
Растения выращивали в течение 7 сут в водной культуре в шкафу искусственного климата Биотрон 3 (СибФТИ СО РАСХН, Россия) при температуре 23 ± 1°С, освещенности 10 клк и 10-часовом световом дне. Предварительно семена про-
травливали в течение 20 мин в 0.5% растворе КМп04 и замачивали в темноте в течение 24 ч. Затем проклюнувшиеся семена высаживали на сеточки с марлей, частично погруженные в кюветы с водой. Учитывая возможность оценки термостабильности клеточных мембран по изменению их проницаемости для электролитов [3, 16, 17], мы изучали динамику экзоосмоса электролитов из интактных растительных тканей листьев при воздействии повышенных температур в диапазоне 49—57°С. Данные о температурной зависимости проницаемости мембран использовали для определения кинетических параметров термостабильности мембран с помощью оригинальных авторских разработок (см. раздел Результаты) — температуры порогового повреждения мембран (ТППМ) и тангенса угла наклона температурных кривых, характеризующих амплитуду и скорость термотропных мембранных перестроек.
Проницаемость мембран. Навески срезанных листьев (250 мг) помещали в эрлейнмеровские колбы с 25 мл дистиллированной воды и прогревали в водном термостате в течение 5 мин с интервалом 1°С. Такой режим нагрева был выбран согласно методическому указанию о том, что краткосрочное действие (минуты) супероптимальных температур является тестом на первичную теплоустойчивость растительных клеток, обусловленную прочностью клеточных структур [1]. Контролем служили образцы без тепловой обработки. Проницаемость мембран определяли по выходу электролитов из тканей. Для этого регистрировали электропроводность водных экстрактов на кондуктометре с реохордным мостом ВМ 401 (Те81а, Чехия). После 5-минутного нагревания при заданной температуре навески листьев в колбах инкубировали в воде в течение 2 ч на ротаторе. Затем измеряли электропроводность экстрактов с учетом поправки на воду. Для определения полного выхода электролитов из тканей, принимаемого за 100%, колбы с образцами и экстрактами выдерживали на кипящей водяной бане в течение 30 мин. После охлаждения колб до комнатной температуры вновь определяли электропроводность экстрактов. Проницаемость мембран оценивали по экзоосмосу электролитов, рассчитанному в процентах от полного выхода.
Значения выхода электролитов использовали для расчета коэффициента повреждаемости (КП) мембран по формуле [17]:
КП = х 100 (%) , где
100 - ь°
— выход электролитов из прогретой ткани, % от полного выхода;
Ь0 — выход электролитов из тканей контрольных растений, % от полного выхода.
Величина КП является относительной мерой выхода электролитов, индуцированного только повышенной температурой, поэтому она может быть прямым показателем степени повреждения мембран при нагревании растений.
Экспрессия генов мБТШ. В этих опытах растения выращивали в нормальных условиях (контроль) и при комбинированном действии ТШ и предшествующей засухи. Имеются указания о возможности повышения тепловыносливости растений под влиянием водного стресса в результате обезвоживания [18]. В каждый сосуд с почвой высевали 25 замоченных семян, предварительно протравленных в течение 20 мин 2% раствором ги-похлорида натрия. Контрольные растения выращивали в автоматизированном мини-фитотроне с регулируемой температурой 23 ± 1°С, относительной влажности воздуха около 80%, влажности почвы 70% от полной влагоемкости, освещенности — 5 клк и 10-часовом фотопериоде. После 7 сут выращивания растения подвергали воздействию различных температур и засухи. Засуху создавали, не поливая 5-суточные проростки в течение 2 сут в суховейной камере при 35% влажности воздуха. Схема опытов включала контрольный и четыре опытных варианта: 1 — ТШ (38°С — 30 мин, 40°С - 30 мин, 42°С - 2 ч); 2 - предадаптация (45°С, 15 мин + 23°С, 2ч) и ТШ; 3 - засуха и ТШ; 4 - засуха, предадаптация и ТШ. Такая схема опытов предусматривала возможность развития приобретенной [1] или индуцированной [2] термотолерантности (вариант 1) и воздействие на растения "мягкого" (вариант 2) и "жесткого" (варианты 3 и 4) теплового режима. Из отделенных от растений листьев вырезали среднюю час
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.