БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2014, том 40, № 2, с. 143-151
УДК 591.1.05+592/595 СРАВНИТЕЛЬНАЯ БИОХИМИЯ
термотропное поведение и состав главных молекулярных видов фосфолипидов иглокожих1
© 2014 г. Э. Я. Костецкий, н. М. Санина, П. В. Веланский
Дальневосточный федеральный университет, Владивосток 690091 e-mail: kostetsky@nt.pin.dvgu.ru
Статья принята к печати 6.06.2013 г.
Исследованы состав молекулярных видов и термоиндуцированные фазовые переходы кристалл - жидкий кристалл фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭ) из мышечной ткани шести видов иглокожих, собранных в летний период: морских звезд Distolasterias nipon и Asterias amurensis, морского ежа Strongylocentrotus intermedins, голотурий Eupentacta fraudatrix, Cucumaria frondosa japonica и Apostichopus japonicus. Показано, что фосфолипиды (ФЛ) находятся в оптимальном для функционирования клеточных мембран жидкокристаллическом состоянии. Использование данных по составу молекулярных видов ФЛ для интерпретации их термотропного поведения позволило заключить, что эффективность гомеовязкостной адаптации достигается с помощью различных перестроек в составе алифатических групп ФЛ. Сделан вывод, что фазовые переходы ФХ и ФЭ исследованных видов иглокожих (кроме голотурий) симбатны. Установлено, что наличие высокотемпературного пика на термограммах ФХ из C. frondosa japonica и A. japonicus обусловлено плавлением фосфолипидного домена, состоящего из молекулярных видов с насыщенными алифатическими группами. Такие домены являются причиной значительного смещения области фазовых переходов ФЛ голотурий и морского ежа в сторону температур выше 0°С.
Ключевые слова: фосфолипиды, молекулярные виды фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина, иглокожие, термоадаптация, фазовые переходы кристалл - жидкий кристалл.
Thermotropic behavior and major molecular species composition of phospholipids of echinoderms. E. Ya. Kos-tetsky, N. M. Sanina, P. V. Velansky (Far Eastern Federal University, Vladivostok 690091)
This study examines the molecular species composition and heat-induced crystalline-liquid crystalline phase transitions of phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE) from the muscle tissues of six species of echinoderms collected during the summer: the starfishes Distolasterias nipon and Asterias amurensis, the sea urchin Strongylocentrotus intermedius, and the holothurians Eupentacta fraudatrix, Cucumaria frondosa japonica, and Apostichopus japonicus. Phospholipids (PLs) were in the liquid crystalline state, which is optimal for the functioning of the cell membranes. The use of data on the molecular species composition of PLs for the interpretation of their thermotropic behavior allowed the conclusion that homeoviscous adaptation is achieved by various rearrangements in the composition of the aliphatic groups of PLs. The phase transitions of PC and PE of echinoderms (except holothurians) were symbatic. The presence of a high-temperature peak on the PC thermograms of C. frondosa japonica and A. japonicus is attributable to the melting of the phospholipid domain composed of molecular species with saturated aliphatic groups. Such domains are responsible for a significant shift in the temperature ranges of phase transitions of phospholipids of holothurians and sea urchin towards temperatures above 0°С. (Biologiya Morya, 2014, vol. 40, no. 2, pp. 143-151).
Keywords: phospholipids, molecular species of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine, echinoderms, thermal adaptation, crystalline-liquid crystalline phase transitions.
Известно, что жидкокристаллическое состояние фосфолипидного матрикса биологических мембран, необходимое для нормального протекания различных мембраносвязанных процессов, в пойкилотермных организмах поддерживается независимо от температурных флуктуаций в окружающей среде с помощью компенсаторного механизма (Харакоз, 2001; Guschina, Harwood, 2006). Основная роль в процессе адаптации отводится жирным радикалам (ЖР) липидов биологических мембран, изменение структуры которых влияет на фазовое состояние липидов (Logue et al., 2000). Об эффективности данного механизма можно судить по изменению
термодинамических параметров фазовых переходов кристалл (гель) - жидкий кристалл главных мембра-нообразующих липидов ^атиа, Kostetsky, 2001, 2002; Санина, 2006).
В работах, выполненных нами ранее при исследовании состава фосфолипидов (ФЛ) и термотропного поведения фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭ) мышечной ткани представителей разных типов морских беспозвоночных, собранных в летний и зимний периоды ^атиа, Kostetsky, 2001, 2002; Санина, 2006), было показано, что фазовые переходы обоих Фл в летний период располагаются преимущественно
1 Работа выполнена в рамках гранта Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования (Договор № 11.G34.31.0010) и Госзадания Минобрнауки N4.583 и N4.2007.2011.
ниже -1.7°C (минимальная температура морской воды в зимний период). Тем не менее, температура фазовых переходов ФЭ зимой резко снижается, тогда как термо-тропное поведение ФХ изменяется разнонаправленно. В основе термоадаптационных изменений лежит повышение ненасыщенности алифатических групп ФЛ и увеличение соотношения n-3/n-6 полиненасыщенных жир-нокислотных остатков.
Логичным продолжением этих работ является исследование состава Фл на уровне молекулярных видов в связи с термотропным поведением. Липидам иглокожих посвящен ряд публикации (Drazen et al., 2008; Weaver et al., 2008; Hughes et al., 2011; Костецкий и др., 2012а, б; Carboni et al., 2013), однако в них практически отсутствует информация о термотропных свойствах данных липидов, хотя проблема выживания иглокожих в меняющихся условиях окружающей среды представляет научный (источники перспективных биологически активных веществ) и практический (марикультура) интерес. Исходя из этого целью настоящей работы являлось изучение состава молекулярных видов и фазовых переходов кристалл - жидкий кристалл ФХ и ФЭ из мышечной ткани трех классов иглокожих (Asteroidea, Echinoidea, Holothuroidea).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Шесть видов морских беспозвоночных из типа Echinodermata - морские звезды Distolasterias nipon (Doderlein, 1902) и Asterias amurensis Lutken, 1871, морской еж Strongylocentrotus intermedius (A. Agassiz, 1863), а также голотурии Eupentacta fraudatrix (Djakonov et Baranova, 1958), Cucumaria frondosa japonica (Semper, 1868) и Apostichopus japonicus (Selenka, 1867) были собраны в августе 2010 г. Гонады и печень у морских звезд и морских ежей удаляли, желудочно-кишечный тракт промывали фильтрованной морской водой. У голотурий брали мускульный мешок. Для приготовления липидных экстрактов отбирали не менее пяти особей каждого вида, мышечные ткани которых объединяли. Ткани измельчали и фиксировали в смеси хлороформ-метанол (2 : 1, по объему). Липидный экстракт получали по методу Фольча с соавторами (Folch et al., 1957) и стабилизировали антиоксидантом (0.1-0.05% 2.6-дитретбутил-н-крезола). Выделяли ФХ и ФЭ, а также анализировали молекулярные виды и фазовые переходы ФХ и ФЭ, как описано ранее (Костецкий и др., 2013). Для подтверждения наличия фосфолипидных доменов, состоящих из молекулярных видов с насыщенными алифатическими группами, в составе ФЛ иглокожих использовали 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-З-фосфохолин (Sigma-Aldrich).
Аналитическое разделение молекулярных видов ФХ и ФЭ выполняли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе Shimadzu-LC20 с масс-детектором LCMS-2010EV. Образцы индивидуальных ФЛ перерастворяли в чистом метаноле. Использовали колонку Ascentis C18 (зернение 5 мкм, длина 25 см, диаметр 2.1 мм), температура - 45°C. Элюирование градиентное со скоростью 0.3 мл/мин, состав элюента (вода : метанол : изопропанол, по объему): для ФХ - 8 : 92 : 0 (0-5 мин), 8 : 90 : 2 (40-47 мин), 8 : 77 : 15 (60 мин), 8 : 62 : 30 (65-75 мин), 6 : 92 : 2 (76-90 мин); для ФЭ - 6 : 92 : 2 (0-5 мин), 6 : 86 : 8 (40-47 мин), 6 : 74 : 20 (50-52 мин), 6 : 92 : 2 (53-65 мин). Параметры масс-детектора:
ионизация распылением в электрическом поле, режим детектирования положительных ионов; давление газа (азот) - 0.2 МПа; напряжение на капилляре - 4.5 кВ; поток распыляющего газа (азот) - 1.5 л/мин; температура линии десольватации - 250°С; температура входного интерфейса - 280°С; диапазон сканирования - m/z 650-920 и m/z 620-885 для ФХ и ФЭ соответственно. Для идентификации молекулярных видов дополнительно проводили разделение Фх и ФЭ в режиме детектирования как положительных, так и отрицательных ионов с большей степенью фрагментации. Изменяли следующие параметры масс-детектора: напряжение на капилляре электроспрея составляло -4/+4.5 кВ; постоянное напряжение на предварительном квадруполе (Q-array) составляло -80/+80 В; диапазон сканирования - m/z 180-1000.
Содержание молекулярных видов рассчитывали по площадям пиков хроматограмм по квазимолекулярным ионам [M+H]+; каждый образец анализировали трижды.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для исследований использовали мышечную ткань, в которой содержание ФХ и ФЭ наименее вариабельно по сравнению с таковым в других органах (Костецкий и др., 2012а, б), а содержание этих ФЛ в сумме достигает 76-83% от общих ФЛ (Костецкий, Сергеюк, 1986). Известно, что ФХ и ФЭ асимметрично распределены между внутренними и внешними монослоями биологических мембран (Seddon, Templer, 1995; Генис, 1997) и состав алифатических групп, а следовательно и фазовые переходы этих ФЛ зависят от температуры среды обитания.
Состав молекулярных видов ФХ и ФЭ иглокожих
ФХ мышечной ткани иглокожих содержал большое количество алкилацильных форм (в сумме от 35.6 до 86.2%), среди которых выделялись 18:1а/20:5 (18:1-алкил/20:5-ацил), 16:0а/20:5 и 18:0а/20:5. Главные диацильные формы ФХ были представлены 18:1/20:5, 18:0/20:5, 20:1/20:5 и 16:0/20:5. Морские звезды характеризовались самым высоким суммарным содержанием молекулярных видов НЖР (насыщенные ЖР
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.