МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 76, № 3, с. 321-328
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 577.125
ТЕРМОТРОПНОЕ ПОВЕДЕНИЕ ЛИПИДОВ И МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОК YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ЛИЗОФОСФАТИДИЛЭТАНОЛАМИНА
© 2007 г. С. И. Бахолдина*'1, Н. М Санина**, Ф. Н. Шубин ***, О. Б. Попова**, Т. Ф. Соловьева*
*Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток **Далъневосточный государственный университет, Владивосток ***ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток Поступила в редакцию 18.09.2006 г.
Установлено, что увеличение содержания лизофосфатидилэтаноламина (ЛФЭ) в клетках Yersinia pseudotuberculosis происходит при 8°С в стационарных условиях роста бактерий (без перемешивания питательной среды) и при 37°С - в присутствии глюкозы. Максимальный уровень ЛФЭ (до 45% от суммы фосфолипидов) наблюдается у клеток, выращенных на холоду без перемешивания среды. У этих бактерий снижается скорость роста, уменьшается выход биомассы, изменяется морфология клеток и увеличивается их площадь. Для них характерно низкое содержание ненасыщенных жирных кислот, фосфатидилэтаноламина (ФЭ) и суммарных фосфолипидов (ФЛ), высокий уровень нейтральных липидов и дифосфатидилглицерина, а также появление метиловых эфиров ФЭ и ФЛ неустановленной структуры. Показано, что клетки с высоким содержанием ЛФЭ, независимо от температуры культивирования, имеют высокое значение температуры максимума теплопоглоще-ния (Tmax) липидов (32-36°С), что свидетельствует об уплотнении липидного матрикса мембран этих клеток. Предполагается, что накопление в клетках ЛФЭ является ответом бактерий на стресс, вызванный недостатком кислорода в среде роста (стационарный режим культивирования) или уменьшением pH среды в результате ферментации глюкозы. Обсуждается возможная связь между накоплением ЛФЭ и вирулентностью Y. pseudotuberculosis, растущей при низкой температуре.
Ключевые слова: фосфолипиды, лизофосфолипиды, жирные кислоты, термотропное поведение липидов, морфология, Yersinia pseudotuberculosis.
В бактериальных клетках лизофосфолипиды (лизо-ФЛ) обнаруживаются главным образом в виде лизофосфатидилэтаноламина (ЛФЭ) и обычно их уровень невелик (2-5% от суммы фосфолипидов (ФЛ)). В то же время некоторые виды бактерий могут значительно увеличивать содержание ЛФЭ (до 50% от общего количества ФЛ) в ответ на действие таких факторов, как высокая кислотность среды или высокая температура [1, 2].
Роль лизопроизводных в клетке в настоящее время точно не известна. Предполагается, что в стрессовых условиях ЛФЭ выполняют роль ша-перонов для растворимых белков, предотвращая их агрегацию [2]. Известно, что лизо-ФЛ сами по себе являются биологически активными соединениями, в организме млекопитающих они выполняют важные регуляторные функции, включая их участие в воспалении и иммунитете [3]. С другой стороны, лизо-ФЛ оказывают влияние на структуру и проницаемость липидного бислоя, ко-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: bakholdina@pib-oc.dvo.ru).
торое может быть прямо противоположным в зависимости от липидного состава и кривизны бислоя. Например, на лецитиновый бислой лизо-ФЛ действуют как детергенты, способствуя образованию изотропной фазы [4], тогда как отрицательная кривизна и нестабильность бислоя, обусловленная присутствием неламеллярного фосфатидилэтаноламина (ФЭ), наоборот, устраняются при добавлении лизо-ФЛ [5]. Подобный стабилизирующий эффект оказывают ламеллярные липиды [6].
Накопление лизосоединений в бактериальной клетке может способствовать секреции белков и отделению от мембраны фрагментов (везикул) [7]. Недавно обнаружено, что высокой патоген-ностью обладают варианты Helicobacter pylori, у которых значительно повышено содержание ЛФЭ [8]. Величина отношения ЛФЭ/ФЭ была предложена авторами [8] в качестве маркера вирулентности H. pylori.
Yersinia pseudotuberculosis, вызывающие псевдотуберкулез у человека, относятся к факультативным психрофилам и характеризуются большим разнообразием условий обитания. Они могут
вести как паразитический, так и сапрофитический образ жизни.
Целью настоящей работы было изучение условий накопления ЛФЭ в бактериях Y. pseudotuberculosis, а также и характеристика динамики роста, морфологии и термотропного поведения липидов клеток с высоким содержанием ЛФЭ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериальные штаммы, культивирование бактерий. В работе использовали штамм KS 3058 Yersinia pseudotuberculosis серовара 0:Ib, полученный как описано в работе [9]. Бактерии культивировали на питательном бульоне (ПБ, Махачкала, Россия) и питательном бульоне с добавлением 0.5% глюкозы (ПБ + Glc) в аэробных и анаэробных условиях в колбах объемом 1 л на качалке (180 об./мин), либо в таких же колбах в аэробных условиях, но без перемешивания (стационарные условия). Анаэробные условия создавали путем продувания аргона через вакуумированные колбы объемом 1 л с 150 мл свежекипяченной среды. Стерилизацию вводимого аргона осуществляли с использованием насадки с ультрафильтром с размером пор 0.2 мкм. По достижении стационарной фазы роста через одни сутки при 37°С и через 6 сут при 8°С бактерии убивали 1% раствором фенола в течение 20 мин и отделяли от культуральной жидкости центрифугированием.
Рост бактерий определяли по изменению оптической плотности суспензий на спектрофотометре при X = 600 нм.
Морфологию бактерий, предварительно окрашенных по методу Грама, исследовали в световом микроскопе Axiostar (Германия). Площади клеток рассчитывали, используя программу для обсчета размеров клеток UTHSA Image Tool for Windows v. 2 (США).
Выделение и характеристика липидов. Липид-ные экстракты получали двукратной обработкой клеток смесью хлороформ : метанол (2 : 1, по объему) в течение 2 ч при 8°С. Полярные липиды разделяли двумерной ТСХ в системах, описанных в работе [10]. Фосфолипиды идентифицировали сравнением с заведомыми образцами с использованием специфических реагентов [11]. Общее содержание ФЛ в клетках (в % от веса сухих бактерий) и количество индивидуальных ФЛ (в % от суммы ФЛ) определяли по содержанию фосфора в липид-ных экстрактах методом, описанным в работе [12].
Жирные кислоты (ЖК) получали гидролизом микробной массы 6 М NaOH (100°С, 4 ч) и анализировали в виде метиловых эфиров с помощью газожидкостной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии, как описано в работе [13].
Дифференциальная сканирующая калориметрия. Общие липиды растворяли в хлороформе и вносили в стандартные микроконтейнеры. Затем хлороформ упаривали под вакуумом. Высушенные до постоянной массы (примерно, 5 мг) образцы смешивали с двукратным количеством смеси во-да-этиленгликоль, 2 : 1, по объему, герметично запаковывали и помещали в дифференциальный сканирующий калориметр ДСМ-2M (НПО "Биоприбор", Пущино, Россия). В качестве образца сравнения использовали контейнер, содержащий такое же количество смеси вода-этиленгликоль, что и в опытном образце. Образцы нагревали/охлаждали со скоростью сканирования 16^/мин в интервале температур от -100 до 60°C при чувствительности 40 мВт. Положение максимума теплопоглощения на температурной шкале определяли как температуру фазового перехода. Температурную шкалу калибровали по стандартным образцам нафталина, ртути и индия.
Все данные, приведенные в работе, являются результататами трех и более независимых экспериментов; диапазон экспериментальных ошибок не превышал 5%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние условий культивирования на накопление ЛФЭ в клетках Y. pseudotuberculosis. Бактерии выращивали при двух режимах аэрации -при интенсивном перемешивании и в стационарных условиях (без перемешивания), при 8 и 37°С и на различных питательных средах - питательном бульоне и питательном бульоне с добавлением глюкозы. Сравнительный анализ ФЛ состава этих бактерий (табл. 1) позволил определить условия культивирования, способствующие накоплению в клетках ЛФЭ. Глюкоза является универсальным фактором, увеличивающим содержание ЛФЭ у Y. pseudotuberculosis независимо от температуры и режима аэрации. Клетки, культивируемые на ПБ + Glc, содержат в 1.4-7.5 раза больше ЛФЭ, чем клетки, выращенные без глюкозы. При культивировании бактерий на холоду огромное влияние на накопление ЛФЭ в клетках оказывает степень аэрации питательной среды. В условиях без перемешивания среды роста, в сравнении с интенсивным перемешиванием, уровень ЛФЭ в клетках возрастает в 6-16 раз. При 8°С оба фактора - глюкоза и низкая аэрация действуют аддитивно. Можно предположить, что при стационарном режиме культивирования именно недостаток кислорода, а не отсутствие перемешивания питательной среды, является фактором, вызывающим накопление в клетках ЛФЭ. Чтобы проверить это предположение, бактерии выращивали в анаэробных условиях на качалке. Действительно, при кислородном голодании (анаэробные условия) даже в условиях интенсивного
Таблица 1. Влияние условий культивирования на выход биомассы, морфологию клеток и липидный состав Y. pseudotuberculosis
8° C 37°C
180 об./мин Без перемешивания 180 об./мин Без перемешивания
ПБ ПБ + Glc ПБ ПБ + Glc ПБ ПБ + Glc ПБ ПБ + Glc
1 2 3 4 5 6 7 8
Биомасса мг с 1 л среды 978.0 669.1 253.3 287.0 260.8 216.0 215.1 120.7
Форма клеток Кокки Овоидная Овоидная Овоидная Кокки Овоидная Овоидная Овоидная
Площадь клеток (мкм2) 1.107 ± ± 0.01 1.962 ± ± 0.03 2.576 ± ± 0.03 1.984 ± ± 0.03 1.074 ± ± 0.01 2.021 ± ± 0.03 1.870 ± ± 0.03 2.0 ± 0.03
Выход липидов, % от сухой биомассы бактерий
Общие липиды 7.2 5.5 7.0 5.8 5.1 4.2 5.0 6.0
Фосфолипиды 6.8 5.0 2.1 3.1 4.0 2.1 3.6 1.4
Нейтральные липиды 0.4 0.5 4.9 2.7 1.1 2.1 1.4 4.6
Содержание ФЛ, % от суммы
ФЭ 79.6 79.4 22.7 27.2 73.6 50.8 71.6 48.0
ЛФЭ 2.1 7.7 33.2 45.6 3.1 23.3 3.5 13.0
ФГ 7.9 5.1 12.1 8.3 5.8 1.3 6.8 4.7
ДФГ 8.7 7.9 14.9 16.5 17.5 22.9 18.1 25.7
МеФЭ 1.7 4.8 2.4
X 8.4 1.7 3.8
Х1 + X2 4.7
ФЭ + ЛФЭ/ФГ + ДФГ 5.3 6.7 2.1 2.9 3.3 3.1 3.0 2.4
встряхивания среды роста независимо от ее состава в клетках наблюдался максимально высокий уровень ЛФЭ - 52% от суммы ФЛ (данные не приводятся).
Напротив, при 37°С влияние режима аэрации на содерж
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.