БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 1, с. 129-135
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.336
ТИНДАЛЕВСКИЙ ГИПОХР ОМИЗМ СУСПЕНЗИЙ
© 2015 г. Н.Л. Векшин, М.С. Фролова, В.И. Ковалев, Е.А. Бегунова
Институт биофизики клетки РАН, 142290, ПущиноМосковской области E-mail: nvekshin@rambler.ru Поступила в p едакцию 29.08.14 г. После доработки 30.09.14 г.
Поскольку при прохождении света через суспензию на каждой отдельной частице имеет место конкуренция процессов поглощения и р ассеяния, то за счет этого возникает гипохромизм -снижение коэффициента экстинкции. Величина гипохромизма возрастает при увеличении размеров частицы или ее показателя преломления. Так как тиндалевское светорассеяние суспензий, где размер каждой частицы существенно больше длины волны, не сильно зависит от длины волны, то спектр поглощения (и возбуждения) ослабляется почти равномерно. Предлагается простой метод нахождения истинных коэффициентов экстинкции, спектров поглощения и возбуждения разбавленных суспензий, не обладающих многократным светорассеянием. Приводятся экспериментальные данные по спектрам гомоглобина в эритроцитах, актиномицина в ДНК и флавинов в митохондриях.
Ключевые слова: светорассеяние, гипохромизм, коэффициент экстинкции, спектр поглощения, спектр возбуждения, флуоресценция, латекс, митохондрии, эритроциты, актиномицин, ДНК.
Феномен гипохромизма - снижения коэффициента экстинкции светопоглощающих молекул в неоднородной ср еде - является одним из обязательных спектральных явлений, возникающих в суспензиях, коллоидах, агрегатах молекул и макромолекулах. В частности, в биологических системах гипохромизм наблюдается в белках, ДНК, эритроцитах, хлоропластах и т.д. [1]. Существуют несколько причин гипо-хромного эффекта [2].
Гипохромизм стопкообразно расположенных хромофоров в макромолекулах и молекулярных кластерах во многих случаях удается объяснить с помощью «экранировочной» модели [3], оперирующей сечениями поглощения, напрямую связанными с коэффициентами экстинкции. Эта модель предсказывает конкуренцию хромофоров в стопке за фотон, что про -является в виде взаимного «экранирования», ведущего к снижению коэффициента экстинкции в расчете на один хромофор. Модель пригодна для молекулярных структур, размер которых существенно меньше длины волны - для олигоаденилатов, фрагментированной ДНК и др. [4] (в них светорассеянием можно пренеб-речь). Для небольших молекуляр ных стопкооб-разных хр омофорных структур модель хорошо описывает все явления: снижение коэффициента экстинкции, уширение гипохромного спектра, зависимость величины гипохромизма от количества хромофоров в стопке и их взаимной
ориентации, резкое уменьшение гипохромизма при разупорядочивании стопки, отсутствие новых полос или перекачки в другие полосы.
Для гипохр омизма суспензий, коллоидов и иных частиц, размер которых заметно превышает длину волны, имеются другие модели. Одна из них предполагает «просеивание» световых потоков между частицами, что приводит к не экспоненциальному закону поглощения -«эффекту сита» [5]. Эффект сита зависит от размеров частиц и длины оптического пути света в образце. Модель оперирует с оптическими плотностями, но не с коэффициентами экстинкции. Она годится только для больших частиц в тонком слое. Размеры частиц должны быть многократно больше длины волны, а их количество - чрезвычайно малым [6], иначе никакого «просеивания» не будет [7]. Для растворов макромолекул, агрегатов молекул, большинства коллоидов и мелких суспензий эта модель малопригодна.
Еще одной пр ичиной спектральных изменений может являться многократное рассеяние [8], имеющее место в сильно концентрированных суспензиях. Этот осложняющий случай мы здесь р а ссматривать не будем.
Гипохр омизм суспензий и коллоидов часто пытаются описать с точки зрения светор ассеяния в рамках теории Ми [9]. Сама по себе теория Ми хорошо объясняет светорассеяние на частицах, размер которых превышает длину
волны. Однако ее применение к ра счету гипо-хромного эффекта для многих суспензий оказалось не слишком удачным. Измеряя соотношение между оптической плотностью ра ссеяния и тотальной оптической плотностью (куда вхо -дит и поглощение, и рассеяние), исследователи пытались найти величину «истинного» поглощения [10,11]. Они изначально полагали наличие аддитивности поглощения и рассеяния. Это допущение справедливо для тех систем, где имеются рассеивающие частицы и имеются поглощающие молекулы, причем первые не взаимодействуют со вторыми. В большинстве же экспериментально интер есных случаев (в частности, это касается клеточных органелл) собственные хромофоры или специальные красители находятся внутри рассеивающих частиц. В таких системах за счет рассеяния на каждой частице должна снижаться вер оятность поглощения. Это обстоятельство нигде ранее количественно не учитывалось. Вот почему простая аппроксимация оптической плотности из области рассеяния на область поглощения и ее последующее вычитание не давали приемлемых результатов.
Для количественного описания гипохром-ных спектров суспензий и коллоидов не достаточно аппроксимировать величину светорассеяния из области, где нет поглощения, на область, где оно есть, как это часто делается (см., например, [12]). Ведь спектр поглощения (и возбуждения) хромофора внутри частицы всегда сколько-то гипохромирован по сравнению со спектром свободного хромофора. Для получения истинного спектра поглощения хро -мофора внутри частицы необходимо не только вычесть общее светор ассеяние суспензии из тотальной оптической плотности, но и внести существенную поправку на вер оятность рассеяния света отдельной частицей.
Ниже проводится рассмотрение тиндалев-ского гипохромизма частиц, размер которых существенно больше длины волны (здесь молекулярное релеевское рассеяние дает обычно малый вклад). Для простоты взята однородная разбавленная суспензия, не обладающая мно-гокр атным светорассеянием. Анализируется применение модели для ряда биологически важных структур: эритроцитов, митохондрий и ДНК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Митохондрии из печени крысы выделяли обычным методом с модификациями [13] в буфер е, содержащем 10 мМ трис и 250 мМ сахар озы, рН 7,4.
Эритроциты из крови крысы хр анили в буфер е, содержавшем 10 мМ тр ис, 150 мМ NaCl и 10 мМ цитрата натрия, рН 7,4.
В работе использовали нативную и фраг-ментированную ДНК (Reanal, Венгрия), а также актиномицин Д (Reanal, Венгрия). ДНК растворяли в дистиллированной воде (для ее самопроизвольного сворачивания в клубок) за несколько часов до процедуры встраивания в нее актиномицина Д.
Спектры поглощения и рассеяния регистрировали на спектрофотометрах «ПромЭкоЛаб-5400УФ» (Санкт-Петербург) и «М-40» (Германия) в обычном отсеке, а спектры поглощения с устранением вклада рассеяния - в спецотсеке для мутных образцов спектрофотометра «М-40», где кювета находится вплотную к полусфер ическому детектору, собирающему рассеянный свет.
Спектры возбуждения флавиновой флуор ес-ценции регистрировали на спектрофлуориметре «Perkin-Elmer МРР-44В» в 1-сантиметровых кварцевых кюветах.
Оптическую микроскопию обр азцов и подсчет частиц выполняли на микроскопе Zeiss Imager (Германия).
Перед микроскопированием и фотометри-рованием все суспензии встряхивали на «вор-тексе» для полного устранения слипания частиц.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как известно, оптическая плотность, измеряемая на спектр офотометре за счет поглощения света, определяется законом Бугера-Лам-берта-Бэра [14]:
D = eCL. (1)
Здесь е - коэффициент экстинкции при определенной длине волны, С - концентрация молекул, L - длина оптического пути света в обр азце. Коэффициент экстинкции по сути представляет собой молекулярную площадь, непроницаемую для фотонов [14,15]. Например, е = 6104 М-1см-1 = 1 Á2 [15].
Вероятность поглощения (P) фотона одиночной молекулой красителя в растворе при фиксированной длине волны можно представить в виде отношения двух площадей [14,15]:
P = е/S, (2)
где S - площадь хромофора молекулы красителя. Здесь е выражается в Á2. При этом для линейного осциллятора поглощения не требуется вводить поправки на фактор ориентации
ТИНДАЛЕВСКИЙ ГИПОХРОМИЗМ C УСПЕНЗИЙ
131
Рис. 1. (а) - Спектральная зависимость оптической плотности суспензии латексных частиц диметр ом 0,8 мкм в кюветах с оптическим путем 1 см (вверху), 0,5 см (в середине) и 0,1 см (внизу). Измерено в обычном отсеке спектрофотометр а «М 40». (б) -Оптическая плотность суспензии латексных частиц диметром 1,5 мкм (концентрация 4,8-10-14 М) в «кр а сной области». Измер ено в 1-сантиметр овой кювете на спектрофотометр е «Пр омЭкоЛаб-5400УФ ».
и на пер еход к десятичным логар ифмам В, так как они взаимно компенсируются.
По аналогии с поглощением, вероятность р ассеяния фотонов частицей пр и фиксир ован-ной длине волны тоже можно представить в виде отношения двух площадей:
Р = S/rcR 2,
(3)
где 8 - оптическое сечение рассеяния, котор ое не пр евышает геометр ического попер ечного сечения ча стицы пЯ 2. Для линейного о сциллятор а р а ссеяния также не тр ебует ся вводить попр авки на факто р о р иентации и на пер еход к десятичным логар ифмам В, так как они взаимно ком-пенси р уют ся.
Оптическая плотность светорассеяния В8, измеряемая на спектр офотометр е, может быть описана аналогично закону Бугер а-Ламбер та-Бэр а:
D s = SC sL.
(4)
Р ис. 2. Латексные частицы диметр ом 1,5 ± 0,1 микрон (в воде) в камере Горяева. Микроскоп Zeiss Imager, в режиме светлого поля.
Концентр ацию ча стиц С8 легко опр еделить с помощью микр о скопа. Эта фор мула пр име-нима для экспер иментов на стандар тных спектр офотометр ах пр и не слишком высоких В 8.
X ор ошая выполнимо сть фор мулы (4) для фотометр ического опр еделения величины светор а ссеяния суспензий следует из экспер имента по оптической плотности латексных частиц (р ис. 1а). Здесь спектр офотометр выполняет по сути функцию турбодиметра. Чем выше концентр ация частиц или чем больше длина оптического пути, тем линейно выше оптическая плотность (при фиксированной длине волны). Возр астание оптической плотности в кор отко-волновой области наблюдается для всех частиц размером ме
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.