БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 2, с. 247 - 253
УДК 577.23
ТИОЛЗАВИСИМЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ И ДЫХАНИЯ МИТОХОНДРИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫЕ ДОКСОРУБИЦИНОМ*
© 2006 г. П.Дж. Оливьера1, М.С. Сантос1, К.В. Уэллас2**
1 Center of Neurosciences and Cellular Biology of Coimbra, Department of Zoology, University of Coimbra, Portugal 2 Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Minnesota Medical School, Duluth, USA; fax: (218)726-8014, E-mail: kwallace@d.umn.edu
Поступила в редакцию 09.02.05 После доработки 11.10.05
Доксорубицин (ДР) — высокоэффективный препарат, применяемый для лечения некоторых форм рака. Однако клинический опыт показывает, что в зависимости от дозы вводимого препарата и при его накоплении ДР приводит к развитию кардиомиопатии. Возникновение заболевания объясняется окислительно-восстановительными превращениями лекарства в дыхательной цепи митохондрий, приводящих к образованию свободных радикалов и окислительному стрессу. Нарушения функций митохондрий, такие как возникновение неспецифической проницаемости (МНП) и ингибирование дыхания митохондрий, являются определяющим фактором патогенной кардиотоксичности ДР. Настоящая работа была предпринята с целью установить, является ли ингибирование митохондриального дыхания следствием возникновения МНП в митохондриях, изолированных из сердец крыс, получавших ДР, или же один из или оба результата превращения ДР являются следствием окисления тиоловых остатков в белках. Вызываемый ДР окислительный стресс связан с накоплением продуктов перекисного окисления липидов и с истощением а-токоферола в мембранах митохондрий сердца. В сердцах крыс, принимавших ДР, не наблюдалось никаких изменений в концентрации митохондриальных коэнзимов Q9 и Q10. Митохондрии сердца крыс, получавших ДР, были более чувствительны к диаминзависимой индукции МНП. Несмотря на то что ДР не влиял на дыхание в состоянии 4, скорость дыхания в состоянии 3 снижалась в митохондриях, изолированных из сердец крыс, получавших ДР. Ингибирующее влияние ДР частично обращалось циклоспорином А или дитиотреитолом, но не тролоксом. На основании этих результатов можно заключить, что, во-первых, митохондриальное дыхание, по крайней мере, частично, вызывается индукцией МНП, во-вторых, сердечные митохондрии более чувствительны к диамидиндуцированной МНП, в-третьих, тиолзависимое изменение в митохондриальном дыхании частично обращается ex vivo дитиотреитолом. Совокупность представленных данных согласуется с утверждением, что тиолзависимое изменение МНП и дыхания является важным фактором в индуцируемых ДР нарушениях функций митохондрий.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: доксорубицин, сердце, митохондрии, окислительный стресс.
Хинон антрациклина доксорубицин (ДР, ад-риамицин) применяется для лечения некоторых форм рака и лейкемии человека. Несмотря на его общепризнанную эффективность в лечении этих новообразований, клинический успех ДР ограничен из-за его дозозависимой и кумулятивной кардиотоксичности [1]. Редокс-превращения ДР в комплексе I электрон-транспортной цепи ми-
Принятые сокращения: ДР — доксорубицин, МНП — неспецифическая проницаемость митохондрий, ДТТ — дитиотреитол, ТБКРС — соединения, реагирующие с тио-барбитуровой кислотой, МДА — малоновый диальдегид, ТАН — транслоказа адениновых нуклеотидов.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 05-030, 18.12.2005.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
тохондрий [2, 3] сопровождаются образованием свободных радикалов кислорода, что, в свою очередь, приводит к окислительному стрессу, который считается первичной причиной доксоруби-цининдуцированной кардиотоксичности [4]. Окислительное повреждение митохондрий и кальциевая перегрузка — процессы, связанные с ДР токсичностью [5—8], являются мощными индукторами неспецифической проницаемости митохондрий (МНП) [9]. Следовательно, проок-сидантная природа ДР считается исходной причиной его токсичности. Многие авторы сообщали, что ДР и его метаболиты уменьшают митохонд-риальную кальциевую емкость, что обусловливает открытие МНП поры, как in vitro [10—11], так и in vivo [5—8]. Из этого наблюдения можно с очевидностью заключить, что индуцируя МНП, ДР
248
ОЛИВЬЕРА и др.
влияет на регуляцию кальция в митохондриях, что может быть одной из основных черт патогенеза ДР-индуцируемой кардиомиопатии. К тому же снижение скорости дыхания, наблюдаемое в митохондриях сердца, изолированных из животных, получавших ДР, может быть также следствием усиления индукции МНП [12].
Считается, что окисление специфических ти-оловых остатков в митохондриальных белках является важным регулятором индукции МНП [13]. Белок, содержащий эти критические тиоло-вые остатки, не был идентифицирован, но предполагается, что им может быть транслокатор аде-ниновых нуклеотидов (ТАН) [14]. На основании корреляции между редокс-состоянием митохонд-риального глутатиона и тиоловых групп, а также индукцией МНП и ингибированием митохонд-риального дыхания можно предположить существование причинно-следственной связи между этими, в других отношениях независимыми, событиями. Однако было уже показано, что окисление тиоловых групп, вызванное ДР-индуциро-ванным окислительным стрессом [15], служит причиной перехода митохондрий в состояние, более чувствительное к индукции неспецифической проницаемости. К тому же остается не установленным, является ли ингибирование митохо-ндриального дыхания прямым эффектом ДР-ин-дуцированного окисления тиолов, или оно возникает вследствие индукции МНП.
Настоящее исследование было предпринято с целью установить, является ли увеличение индукции МНП, вызываемое получением ДР in vivo, ответственным за вторичное ингибирова-ние дыхания в состоянии 3. Мы также изучили, влияет ли изменение состояния тиолов на регуляцию как модифицированной МНП, так и дыхания. Мы предположили, что циклоспорин А может обращать ингибирование дыхания, наблюдаемое в митохондриях животных, получавших ДР. К тому же можно ожидать, что сердечные митохондрии этих животных будут более чувствительны к возникновению диамининду-цируемой МНП, и что дитиотреитол (ДТТ) как реагент, восстанавливающий тиолы, будет способен восстанавливать нормальное дыхание митохондрий.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Реактивы. Сверхчистая сахароза получена из «Schwarz/Mann Biotech» (США). ДР приобретен в «Pharmacia & Upjohn» (США). Циклоспорин А был любезно предоставлен «Sandoz Pharmaceuticals» (США). Прочие реактивы были наивысшей чистоты, доступной в «Sigma» (США).
Животные и способ введения лекарств. Самцов крыс линии Sprague Dawley (Harlan Labs, США), весом 200—300 г, содержали в AAALAC-аккредитированных, устройствах с контролем климата и в условиях полного доступа пищи (Purina Chow) и воды. Все эксперименты проводились в соответствии с Правилами по уходу и использованию лабораторных животных. Крысы случайным образом были разделены на две экспериментальные группы: получавших соль или получавших ДР. Крысы получали по семь еженедельных подкожных инъекций либо ДР (2 мг/кг), либо эквивалентного объема солевого раствора (1 мл/кг). Доза ДР была подобрана в предыдущих экспериментах, в которых были продемонстрированы повреждения и гистопатология сердечных митохондрий [6, 7]. Животных убивали декапитацией через одну неделю после последней инъекции, сердца немедленно вырезали и помещали в холодный буфер для выделения митохондрий. Тела и сердца крыс взвешивали в день эксперимента. Крысы, получавшие ДР, имели сниженный вес сердца (1,17 ± 0,09 г против 1,54 ± 0,06 г,p < 0,05, n = 10) и тела (287,3 ± ± 5,6 г против 386,6 ± 6,6 г,p < 0,05, n = 10).
Выделение митохондрий сердца. Митохондрии сердца выделяли методом дифференциального центрифугирования. Сердца тщательно измельчали в охлажденной на льду среде выделения, содержавшей 250 мМ сахарозы, 1 мМ ЭГТА, 10 мМ Hepes-KOH, pH 7,4, и 0,1%-ный БСА, свободный от жирных кислот. Измельченную ткань суспендировали в 40 мл среды выделения, содержавшей дополнительно 0,5 мг протеазы типа VIII («Sigma» P5390) на 1 г ткани, и гомогенизировали в плотно притертом гомогенизаторе (тефлон : стекло). Суспезию инкубировали 1 мин при 4° и гомогенизировали повторно. Затем, го-могенат центрифугировали 10 мин при 9500 g. Супернатант отбросили, а осадок мягко ресус-пендировали в исходном объеме. Суспензию центрифугировали 10 мин при 900 g, а затем полученный супернатант центрифугировали 10 мин при 9000 g. Этот осадок ресуспендировали с помощью кисточки и дважды переосадили центрифугированием при 9000 g в течение 10 мин. Конечная среда промывания не содержала ЭГТА и свободного от жирных кислот БСА. Содержание митохондриальных белков определяли по методу Брэдфорд, с БСА в качестве стандарта [15]. Выход по митохондриальному белку (мг белка на 1 г ткани сердца) не отличался для контрольной и опытной групп животных (5,5 ± 0,5 для контроля и 5,2 ± 0,2 для ДР-группы, n = 8).
Поглощение кислорода. Поглощение кислорода изолированными митохондриями сердца регистрировали полярографическим методом с
помощью электрода Кларка, присоединенного к подходящему регистрирующему устройству. Реакцию проводили при 25° в 1 мл среды, содержавшей 100 мМ KCl, 50 мМ сахарозы, 10 мМ Tris-Mops, 10 мкМ ЭГТА и 2,5 мМ KH2PO4 (pH 7,4). Митохондрии суспендировали в среде измерения дыхания в концентрации 0,25 мг/мл. Дыхание в состоянии 4 измеряли в присутствии 5 мМ глутамата/малата. Состояние 3 дыхания индуцировали внесением ADP (210 нмоль). Величину ADP/О вычисляли стандартным способом [16]. Тролокс (100 мкМ), ДТТ (1 мМ) и циклоспорин А (0,5 мкМ) были добавлены за три минуты до энергизации митохондрий.
Набухание митохондрий. Изменения объема митохондрий регистрировали по изменению светорассеивания при 540 нм. Измерения проводили в 1,5 мл неионной среды, состоявшей из 200 мМ сахарозы, 10 мМ Tris-Mops, 10 мкМ ЭГТА, 5 мМ KH2PO4 (pH 7,4, 25°) и 2 мкМ ротенона, к которой добавляли 0,5 мг белка митохондрий. Эта экспериментальная среда отличалась от среды, использовавшейся в опытах по дыханию, т.к. нужно было создать условия для хорошей
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.