БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 5, с. 531-538
ОБЗОРНАЯ СТАТЬЯ
УДК 577.15
ТИРОЗИЛ-ДНК-ФОСФОДИЭСТЕРАЗА 1 - НОВЫЙ УЧАСТНИК РЕПАРАЦИИ АПУРИНОВЫХ/АПИРИМИДИНОВЫХ САЙТОВ В ДНК1
© 2015 г. Н. И. Речкунова, Н. А. Лебедева, О. И. Лаврик#
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск, пр. Лаврентьева, 8 Новосибирский государственный университет, Новосибирск Поступила в редакцию 15.03.2015 г. Принята к печати 24.04.2015 г.
Геномная ДНК постоянно повреждается под действием внешних факторов и внутренних реакцион-носпособных метаболитов. К наиболее распространенным повреждениям ДНК относится образование апуриновых/апиримидиновых сайтов (АР-сайтов), которые возникают в результате действия ДНК-гликозилаз, а также спонтанного гидролиза Ж-гликозидных связей. Химическая реакционно-способность АР-сайтов является причиной образования разрывов в молекуле ДНК, а также сшивок ДНК-белок и ДНК-ДНК. Репарация АР-сайтов — один из важнейших механизмов сохранения стабильности генома. Несмотря на то, что основные участники репарации АР-сайтов достаточно хорошо изучены, обнаруживаются новые белки, которые могут быть вовлечены в этот процесс в качестве "запасных игроков", либо могут выполнять определенные специализированные функции. Предлагаемый обзор посвящен одному из таких белков, тирозил-ДНК-фосфодиэстеразе 1 человека (Тёр1), для которой мы недавно показали, что помимо своей основной активности удалять кова-лентные аддукты топоизомеразы I (Тор1) и ДНК, этот фермент способен гидролизовать АР-сайты в ДНК и инициировать их репарацию. Впервые Тёр1 была обнаружена в дрожжах Saccharomyces сеге-visiae как фермент, гидролизующий ковалентную связь между остатком тирозина и З'-фосфатной группой ДНК. Тёр1 считается основным ферментом, осуществляющим репарацию необратимых комплексов топоизомеразы I с ДНК, которые стабилизируются в присутствии ингибиторов Тор1, таких как камптотецин, поэтому Тёр1 может служить важной мишенью для разработки ингибиторов — антираковых препаратов. Кроме этого, Тёр1 удаляет широкий спектр З'-концевых модифицированных звеньев в ДНК, а также З'-концевые нуклеозиды и их производные с образованием З'-фосфата. Способность Тёр1 расщеплять АР-сайты позволяет предположить ее участие в процессе эксцизионной репарации оснований в качестве альтернативного фермента вместо АР-эндонукле-азы 1 — основного фермента, гидролизующего АР-сайты в процессе репарации ДНК.
Ключевые слова: тирозил-ДНК-фосфодиэстераза 1, апуриновые/апиримидиновые сайты, эксцизионная репарация оснований, ингибиторы ферментов репарации ДНК.
БОТ: 10.7868/80132342315050127
ВВЕДЕНИЕ
Тирозил-ДНК-фосфодиэстераза 1 (Tdpl) впервые была обнаружена в дрожжах Saccharomyces cerevisiae как фермент, гидролизующий ковалентную связь
1 Статья публикуется по материалам сообщения, представленного на VII Российском симпозиуме "Белки и пептиды"; Новосибирск, 12—17 июля 2015 г.
Список сокращений: АР-сайт — апуриновый/апиримиди-новый сайт, 5'-dRibP — 5'-дезоксирибозофосфат, DD — де-кандиол, DEG — диэтиленгликоль, hhTHF — 3-гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофуран, 3'-P — З'-фосфат, 5'-P — 5'-фосфат, PNKP — полинуклеотидкиназа/фосфатаза, SCAN1 — синдром спиноцеребеллярной атаксии с аксональ-ной невропатией, Tdp1 — тирозил-ДНК-фосфодиэстераза 1, Top1 — ДНК-топоизомераза I, UDG — урацил-ДНК гликози-лаза, XRCC1 — белок, ответственный за радиочувствительность клеток, ЭРО — эксцизионная репарация оснований. #Автор для переписки (тел.: +7(383) 363-51-95; факс: +7 (383) 363-51-53; e-mail: lavrik@niboch.nsc.ru).
между остатком тирозина и З'-фосфатной группой ДНК [1]. Поскольку единственным известным ферментом, формирующим З'-фосфотирозильное соединение in vivo, является ДНК-топоизомераза I (Topl), предположили, что обнаруженная активность вовлечена в репарацию повреждений ДНК, возникающих в результате образования необратимых комплексов Topl с ДНК. Если нет каких-либо к тому препятствий, Topl расщепляет и вновь лигирует цепь ДНК в участке узнавания. Процесс катализа включает образование кова-лентного ДНК-белкового интермедиата между каталитическим остатком тирозина в активном центре фермента и З'-концом расщепленной цепи ДНК. Такой интермедиат обычно рассматривается как Тор1-ДНК-расщепленный комплекс [2—4].
После перемещения разорванных концов ДНК относительно друг друга, в результате чего снимается локальное напряжение в дуплексе, Topi восстанавливает целостность ДНК, катализируя реакцию лигирования разорванной цепи. В нормальных условиях скорость реакции лигиро-вания значительно выше, чем скорость расщепления, но переходные комплексы могут быть стабилизированы. Так, антираковый препарат камп-тотецин связывает ковалентный комплекс ДНК и Тор1 и тем самым блокирует процесс религирова-ния разорванной нити ДНК. Наряду с камптотеци-ном многие ДНК-аддукты и поврежденные основания в ДНК, такие как урацил, 8-оксогуанин, неправильно спаренные основания (мисматчи) или разрывы в ДНК, расположенные вблизи сайта узнавания Тор1, могут стабилизировать Тор1-ДНК-рас-щепленный комплекс [5—7].
Кроме того, мы обнаружили, что ковалентные аддукты Тор1 дрожжей и человека с ДНК-структурами, содержащими в одной из цепей разрыв или короткую брешь, могут формироваться и в отсутствие специфических сайтов узнавания [8—10]. Ковалентный комплекс Тор1-ДНК создает повреждение ДНК, затрудняющее репликацию и транскрипцию [11—13]. Считается, что удаление Тор1 с З'-конца разрыва ДНК в необратимом комплексе является основной функцией Tdp1 в клетке [1, 14]. В то же время, Tdp1 неспособна удалять полноразмерную Тор1, поэтому необходима ее предварительная протеолитическая деградация [1, 15, 16]. Физиологическая важность Tdp1 в организме человека подтверждается наличием редкого рецессивного аутосомного нейродегенеративного заболевания — спиноцеребеллярной атаксии с аксо-нальной невропатией (spinocerebellar ataxia with axonal neuropathy, SCAN1), вызванной гомозиготной мутацией в гене TDP1 [17].
Tdp1 - "ЧИСТИЛЬЩИК" 3'-КОНЦОВ ДНК
Помимо расщепления фосфотирозильной связи Tdp1 удаляет широкий спектр З'-концевых модифицированных звеньев ДНК, в том числе 3'-фосфогликоляты и 3'-дезоксирибозофосфат, образующиеся в результате окислительного повреждения ДНК, а также под действием радиомимети-ков, таких как блеомицин [18, 19]. Биологическая значимость этой функции Tdp1 подтверждается тем, что дефицитные по этому белку клетки более чувствительны к окислительным повреждениям ДНК как в митохондриях, так и в ядре [20-22]. Tdp1 проявляет также нуклеозидазную активность, удаляя 3'-концевые дезоксирибо- и рибонуклеозиды, а также терминирующие синтез ДНК аналоги нук-леозидов, широко используемые в качестве противовирусных и противораковых препаратов [16, 23, 24]. В результате образуются З'-фосфори-лированные концы ДНК, устойчивые к действию
фермента. Кроме того, Tdp1 гидролизует широкий спектр синтетических ДНК-аддуктов, образующихся в результате присоединения к 3'-кон-цевой фосфатной группе ДНК таких молекул, как биотин и различные флуорофоры [16, 23-27]. Это свойство может быть использовано для скрининга ингибиторов Tdp1 и детального изучения его механизма флуоресцентными методами.
СТРУКТУРА Tdp1 И МЕХАНИЗМ РЕАКЦИИ
Tdp1 человека — полипептид массой 68 кДа, включающий 608 а.о. Белок состоит из двух доменов. ^-Концевой домен, лишенный ферментативной активности, отвечает за стабильность белка, тогда как С-концевой домен является каталитическим и относится к семейству фосфолипаз D [28]. В С-концевом домене расположены два каталитических мотива (H263/K265/N283 и H493/K495/N516 в белке человека), разделенные 210 а.о. К настоящему времени установлена кристаллическая структура "усеченной" Tdp1 человека (Д1-148), не содержащей ^-концевого фрагмента, в комплексе с одно-цепочечной ДНК, присоединенной к короткому тирозильному пептиду, и ионом ванадия, имитирующим фосфатную группу, присоединенную к каталитическому остатку тирозина Top1 [29, 30]. Tdp1 функционирует как мономер, в котором два каталитических мотива располагаются достаточно близко друг к другу и формируют активный центр внутри асимметричного, относительно узкого положительно заряженного канала в белке, связывающего одноцепочечную ДНК в составе субстрата. В месте расположения пептидной части субстрата канал расширяется. Одноцепочечная ДНК удерживается в участке связывания за счет полярных взаимодействий, в которые вовлечены 5'-фосфатные группы трех прилегающих к фос-фотирозильной связи нуклеотидов и аминокислотные остатки S400, S403, K469, S518, K519 и A520. Важную роль играют также гидрофобные взаимодействия. Фермент эффективно удаляет не только аддукты Top 1-ДНК, но и различные 3'-блокирующие группировки независимо от последовательности ДНК.
Для проявления каталитической активности Tdp1 не требуются нуклеотидные кофакторы или ионы Me2+. Достаточно сложный механизм действия этого фермента включает две стадии с образованием переходного ковалентного интермедиа-та, включающего субстрат [28]. Первая стадия процесса - нуклеофильная атака фосфотирозильной связи Top1-ДНК остатком гистидина H263. Остаток H493 другого каталитического мотива выступает в качестве донора протона для тирозинсодержа-щей уходящей группы. В результате образуется ковалентная фосфоамидная связь между H263 и 3'-концом ДНК. Остаток H493 выступает в качестве основания и гидролизует образовавшийся
5'-3'.
ОН
О^
НО
О
■О^О-
ЕпёоШ
О
Н
"О ,он оао-
5'' 3'.
О О ■ОАО-
3' 5' 5' 3'
V
НО О
■ОН
\'О~
АРЕ1
О
ОН
о ,о-
Л-
3' 5' 5' 3'
Тёр1
V
■о он
"О ,он А
О о—
'3' ' 5'
Рис. 1. Схема гидролиза АР-сайта различными ферментами.
интермедиат путем активации молекулы воды [29]. В результате образуется ДНК-продукт с 3'-фосфат-ной группой, для процессинга которого необходима полинуклеотидкиназа/фосфатаза (РМКР) [31]. Мутация, приводящая к замене одного из каталитических гистидинов на аргинин (Н493Я), ведет к накоплению ковалентного интермедиата Тёр 1-ДНК [32] и является причиной возникновения нейроде-генеративного расстройства 8СА№ [17]. Болезнь проявляется только в случа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.