БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 3, с. 372 - 378
УДК 577.218
ТКАНЕСПЕЦИФИЧНОСТЬ МЕТИЛИРОВАНИЯ ЦИТОЗИНОВ В РЕГУЛЯТОРНЫХ УЧАСТКАХ ЧЕТЫРЕХ ГЕНОВ ЛОКУСА FXYD5—COX7A1 ХРОМОСОМЫ 19 ЧЕЛОВЕКА: СВЯЗЬ С УРОВНЕМ ИХ ЭКСПРЕССИИ*
© 2006 г. Т.В. Чалая, С.Б. Акопов**, Л.Г. Николаев, Е.Д. Свердлов
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва, ул. Миклухо-Маклая,16/10; fax: (495)330-6538, электронная почта: akser@humgen.siobc.ras.ru
Поступила в редакцию 17.10.05 После доработки 03.11.05
Проведено сравнение степени метилирования отдельных сайтов CpG, находящихся в промоторных областях четырех генов человека, и уровня экспрессии этих генов в нескольких клеточных линиях и тканях человека. По зависимости экспрессии от метилирования CpG в их 5'-областях изученные гены разделены на две группы. В первую из них, где связь метилирования с уровнем транскрипции прослеживается четко, вошли ген домашнего хозяйства COX6B (отсутствие метилирования однозначно коррелирует с экспрессией) и экспрессирующийся только в уротелии ген уроплакина (отсутствие метилирования строго совпадает с отсутствием экспрессии). Вторую группу составили гены, экспрессия которых наблюдается во многих, но не во всех тканях и клетках. Для этих генов (LEAP-1 и ATP4A) корреляция метилирования и экспрессии отсутствует. Можно предположить, что метилирование обеспечивает некоторый базальный уровень репрессии гена, который преодолевается за счет тканеспецифичных факторов транскрипции, тогда как отсутствие метилирования дает гену возможность экспрессироваться в широком наборе клеток и тканей.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: геном человека, метилирование цитозинов, регуляция генов.
Большое содержание и относительно равномерное распределение по геному метилированного цитозина в составе динуклеотида СрО характерно для позвоночных. Функции метилирования генома сегодня до конца не установлены. У млекопитающих метилирование ДНК участвует в инактивации Х-хромосомы [1], подавлении активности мобильных элементов [2], имп-ринтинге [3], опухолеобразовании [4]. Адекватное геномное метилирование необходимо для нормального развития млекопитающих [5].
Изменение распределения 5-метилцитози-нов в геномах различных типов клеток и на разных стадиях развития организма наводит на мысль, что метилирование ДНК может быть одним из эпигенетических факторов, определяющих клеточную дифференцировку и тканеспе-цифичную экспрессию генов.
Принятые сокращения: ОТ-ПЦР — ПЦР на матрице обратно-транскрибированной РНК (RT-PCR); п.о. — пар оснований; ДТТ — дитиотреитол.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 05-226, 16.02.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
К настоящему моменту накопилось множество указаний на связь степени метилирования определенных сайтов генома с экспрессией соответствующих генов в различных тканях позвоночных [6—9]. В частности, считается, что метилирование определенных сайтов, главным образом в промоторной области, способно подавлять активность соответствующего гена [10]. Необходимо отметить, что метилирование некоторых регу-ляторных последовательностей может коррелировать и с активацией транскрипции. Наиболее известный пример — метилирование регулятор-ного участка ICR (imprinting control region) в ло-кусе H19/Igf2 у человека и мышей. ICR представляет собой инсулятор гена Igf2. Он разобщает Igf2 с энхансером, расположенным на расстоянии в несколько десятков тысяч пар оснований (п.о.). Метилирование ICR нарушает его репрессирующую функцию и активирует транскрипцию Igf2. Поскольку ICR метилирован только на отцовской хромосоме, то экспрессия Igf2 моноаллельна: отцовская аллель активна, а материнская же в норме инактивирована, что коррелирует с отсутствием метилирования ICR [11].
Однако в ряде случаев какой-либо корреляции между метилированием и уровнем экспрес-
сии гена не наблюдалось. Было показано, что тканеспецифично-экспрессирующиеся гены, которые, как предполагалось, регулируются метилированием, продолжают нормально функционировать в дефектных по ДНК-метилтранс-феразе эмбрионах мыши [12]. Поэтому вопрос о том, насколько типична регуляция тканеспеци-фичности экспрессии с помощью метилирования, остается открытым, и для ответа на него необходимы дополнительные данные о профилях метилирования геномов млекопитающих в различных типах клеток.
Удобной моделью для изучения тканеспеци-фичности метилирования ДНК может служить локус генома человека длиной 1 млн. п.о., находящийся на хромосоме 19 между маркерами ВХУБ5 и С0Х7А1, содержащий 40 идентифицированных и ряд гипотетических генов, многие из которых экспрессируются тканеспецифично [13]. Определение статуса метилирования потенциальных регуляторных последовательностей генов данного локуса в различных тканях и линиях клеток человека в связи с активностью соответствующих генов может способствовать лучшему пониманию роли метилирования в регуляции экспрессии генов.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Ткани и линии клеток человека. Использованы клеточные линии Tera-1 (эмбриональная карцинома, ATCC HTB-105), HL-60 (промиело-цитарная лимфобластома, ATCC CRL-1964), NGP-127 (нейробластома, любезно предоставлена P.S. Meltzer [14]) и 293 (линия клеток почки эмбриона человека, трансформированных ДНК аденовируса Ad5, АТСС CRL-1573), а также ткани мозжечка, печени, почки и желудка человека.
Выделение геномной ДНК. Геномную ДНК из тканей выделяли с использованием набора Wizard Genomic DNA Purification Kit в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя («Promega», США).
Геномную ДНК из клеточных линий выделяли описанным ниже способом. Клеточную суспензию (3 • 106 клеток) осаждали 5 мин центрифугированием при 150 g. Осадок трижды промывали холодным раствором PBS (Phosphate Buffered Saline) и ресуспендировали в 20 мкл ТЕ (10 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 1 мМ ЭДТА). К суспензии добавляли 200 мкл лизирующего буфера (10 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 100 мМ ЭДТА, 0,5%-ный SDS) и раствор РНКазы А до концентрации 20 мкг/мл. Суспензию инкубировали в течение 1—1,5 ч при 37°, добавляли к ней протеиназу К (до 100 мкг/мл) и инкубировали в течение ночи
при 50—56°. Лизат депротеинизировали смесью фенола (рН 8,0), хлороформа и изоамилового спирта (25 : 24 : 1). Экстракцию повторяли до полного исчезновения интерфазы. Геномную ДНК осаждали 96%-ным этанолом в 0,3 М ацетате натрия 1 ч при —70°. Осадок промывали холодным 75%-ным этанолом, растворяли при 65° и перемешивании в буфере TE. Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре GeneQuant («Amersham Pharmacia Biotech», Швеция).
Выделение суммарной РНК. Суммарную РНК из клеточных линий выделяли с использованием набора RNeasy в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя («Qiagen», Германия). Суспензию клеток (~1,5 • 107) осаждали 5 мин центрифугированием при 150 g, осадок промывали холодным PBS, затем действовали в соответствии с протоколом. Концентрацию полученной РНК определяли с помощью спектрофотометра GeneQuant, качество препарата контролировали электрофорезом в 1%-ном ага-розном геле.
Для удаления примесей геномной ДНК к 6—10 мкг суммарной РНК добавляли 3 ед. ДНКазы RQ1 («Promega»), 60 ед. РНКазина, ди-тиотреитол (ДТТ) до 10 мМ. Реакцию проводили в течение 10 мин при 37° в рекомендованном фирмой-производителем буфере. Далее добавляли ацетат натрия до концентрации 0,3 М и РНК дважды депротеинизировали смесью фенола (рН 5,5), хлороформа и изоамилового спирта (25 : 24 : 1). РНК осаждали 96%-ным этанолом при —70° в течение ночи. Осадок дважды промывали 70%-ным этанолом, растворяли в воде и хранили при —70°.
Гидролиз геномной ДНК рестрикционными эн-донуклеазами. Перед гидролизом геномную ДНК прогревали при 65° при перемешивании в течение 30 мин. Гидролиз проводили в 50 или 100 мкл соответствующего буфера, содержавшего 0,1%-ный Triton Х-100, 1 мкг ДНК и 20 ед. активности фермента (MspI или Hpall). Реакционную смесь инкубировали в течение 4 ч при 37°, затем добавляли еще 20 ед. соответствующего фермента и инкубировали дополнительно в течение ночи. После этого эндонуклеазу инакти-вировали прогреванием при 70° в течение 10 мин.
Полноту гидролиза определяли с помощью электрофореза в агарозном геле и путем ПЦР-амплификации гидролизованной ДНК с прай-мерами к окружению неметилированного в норме сайта —166 в промоторной области гена BRCA1 [15]. Последовательности праймеров: 5'-CAG-GCAAATTCGGCGCTCAC, 5'-GAGGGACAG-AAAGAGCCAAGCG. Для контроля в качестве матрицы использовали соответствующую геномную ДНК, инкубировавшуюся в рестрикци-
онном буфере по той же схеме, но с добавлением вместо ферментов деионизированной воды.
Синтез первой цепи кДНК на матрице суммарной РНК. Готовили две смеси (20 мкл каждая). Реакционная смесь 1 содержала 2 мкг суммарной РНК и 0,2 мкг гексануклеотидной затравки; реакционная смесь 2 — 20 ед. РНКазина, экви-молярные количества дезоксирибонуклеозид-трифосфатов (конечная концентрация 125 мкМ каждого), ДТТ (конечная концентрация 0,1 М) и 10 ед. обратной транскриптазы AMV («Pro-mega»). Обе смеси готовили в однократном буфере для обратной транскриптазы AMV, рекомендованном фирмой-производителем.
Реакционную смесь 1 прогревали 3 мин при 70° и охлаждали на льду. Далее обе смеси помещали в ПЦР-амплификатор, температуру доводили до 20°, после чего к смеси 1 добавляли реакционную смесь 2. Далее синтез кДНК проводили в следующем режиме: 20° — 10 мин, 37° — 30 мин, 42° — 45 мин. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до 20 мМ.
Полимеразная цепная реакция. Для определения метилирования промоторных областей использовали следующие праймеры к окружению исследуемых сайтов: 5'-AAGAAATACCTGA-CACAGAAAAAGC, 5'-CCAGCAAGAGAACTA-CGACTTTC (WX6B); 5'-CTGCTCAGGGCTAT-CTAGTGTTCC, 5'-CACTGGGCTCTCACCTG-TTGT (LEAP-1); 5'-CTTTACAGGGCTGCTGT-TAGATG, 5'-AGCTGATTACAGGCTCCTTGG (ATP4A); 5'-CCATAGAGAGTGTTGTAAGCATGG, 5'-TGGAGTGAGAACCAGATCAGC' (альтернативная пара праймеров к окружению сайта —590 в промоторной области ATP4A); 5'-GCCCTGA-TTTGGATCTTGCTC, 5'-CCCCTCCTCACCTT-CTCTGTC (UPK1A). Праймеры конструировали с использова
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.