Т^а-АССОЦИИРОВАННОЕ НАРУШЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ ФУНКЦИИ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК БОЛЬНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ ГЛИОМАМИ
ГОЛОВНОГО МОЗГА
Тыринова Т. В., Леплина О. Ю., Мишинов С. В.1, Ступак В. В.1
ФГБУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН; ФГУ НИИ Травматологии и ортопедии
Росмедтехнологий, Новосибирск, Россия
Целью настоящей работы явилось изучение возможных механизмов дефектности цито-токсической активности дендритных клеток, генерированных из моноцитов крови в присутствии интерферона-альфа (№Ы-ДК) в группе больных глиобластомой. Продемонстрировано, что цитотоксическая функция №Ы-ДК против опухолевых клеток НЕр-2 в группе здоровых доноров опосредуется с вовлечением TNFa/TNF-RI сигнального пути. При исследовании больных глиобластомой показано, что характеризуются более низкой экспрессии мембранной формы TNFa, что коррелирует с низким уровнем цитотоксично-сти ДК против НЕр-2 клеток. Добавление ^-2 в культуры ДК больных глиобластомой приводит к возрастанию противоопухолевой цитотоксической активности и более высокому уровню экспрессии TNFa.
Ключевые слова: дендритные клетки, глиобластома, фактор некроза опухоли альфа, ^-2
Дендритные клетки (ДК), будучи профессиональными антигенпрезентирующими клетками, играют ведущую роль в запуске специфического противоопухолевого и противовирусного иммунного ответа [1]. Однако исследования последних лет демонстрируют, что ДК обладают прямой противоопухолевой ци-тотоксической/цитостатической активностью и способны подавлять рост и пролиферацию опухолевых клеток [2, 3]. Цитотоксическая активность ДК может существенно облегчать последующую кросс-презентацию опухолевых антигенов и способствовать более эффективному запуску противоопухолевого иммунного ответа. Соответственно дефектность цитотоксической функции ДК может иметь немаловажное значение в патогенезе опухолевых заболеваний. Согласно полученным нами данным ДК здоровых доноров, генерированные в присутствие IFNa (IFN-ДК), экспрес-сируют широкий спектр проапоптогенных молекул (TRAIL, FasL, B7-H1, перфорин) и до-зозависимо лизируют различные опухолевые линии (HEp-2, Jurkat, U-87) [4,5]. При этом предварительные исследования показали, что IFN-ДК при онкопатологии (злокачественная глиома головного мозга и злокачественная
лимфома) характеризуются сниженной ци-тотоксической активностью против TRAIL-резистентных опухолевых клеток НЕр-2 [5]. Дефектность цитотоксической функции ДК может иметь патогенетическую значимость при опухолевом росте. Действительно нарушение цитотоксической функции ДК при гли-альных опухолях головного мозга выявлялось только при высокой степени злокачественности (Grade III-IV) и отсутствовало при низкой степени злокачественности (Grade I—II) [6]. В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение возможных механизмов дефектности цитотоксической активности ДК в группе больных злокачественными глиаль-ными опухолями головного мозга.
Материал и методы. В исследование были включены 16 здоровых доноров и 18 больных опухолями головного мозга с гистологически верифицированной глибластомой (Grade IV). Обследование всех пациентов проводилось при наличии письменного информированного согласия. Мононуклеарные клетки (МНК) получали центрифугированием гепаринизи-рованной венозной крови в градиенте плотности фиколла-верографина. ДК получали путем культивирования прилипающей фрак-
412
Иммунорегуляция
ции МНК в 6-луночных планшетах (Nunclon, Дания) в течение 3-4 сут в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, США), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 5% сыворотки плодов коровы (FCS, БиолоТ, Санкт-Петербург), в присутствии GM-CSF (40 нг/мл, Sigma-Aldrich) и IFNa (1000 Ед/мл, Роферон-А, Roche, Швейцария) с последующим дозреванием в течение 24ч с липополисахаридом (10 мкг/мл, LPS E.colli 0114: B4, Sigma-Aldrich). В качестве клеток-мишеней использовалась эпителиальная опухолевая линия НЕр-2 (карцинома гортани человека). Оценка цитотоксической активности ДК против опухолевых клеток проводилась с помощью МТТ-теста в течение 24 часов в соотношении эффектор/мишень 1:1. Расчет цито-токсической активности проводился по стандартной формуле: (%) = [1- (ОПэ+м-ОПэ) / ОПм] x 100%, где ОПэ+м - значение оптической плотности в опытных сериях; ОПэ - значение оптической плотности в лунках с эффекторами; ОПм - значение оптической плотности в лунках с мишенями. Оптическая плотность измерялась при длине волны 492 нм на мульти-луночном спектрофотометре (Thermo Scientific Multiskan FC, Finland). Для изучения роли отдельных сигнальных путей в реализации ци-тотоксической активности ДК в отдельных экспериментах IFN-ДК предварительно инкубировали в течение 60 мин с химерными молекулами rhTNFR1/TNFRSF1A Fc chimera (10 мкг/мл), rhFas/TNFRSF6/CD95 Fc chimera (10 мкг/мл) и rhTRAIL R2/TNFRSF10B Fc chimera (10 мкг/мл; все реактивы R&D Systems, США). Фенотипирование ДК проводили методом проточной цитофлюориметрии с использованием моноклональных анти-HLA-DR и анти-TNFa-антител (BD PharMingen, США). Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета прикладных программ Statistica 6.0 для Windows. Для выявления значимых различий сравниваемых показателей использовали непараметрический U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости p < 0,05.
Результаты и обсуждение. Поскольку ци-тотоксический потенциал IFN-ДК обусловлен экспрессией различных молекул с проапоп-тогенной активностью, нами было проведено исследование возможных сигнальных путей, опосредующих цитотоксическую активность IFN-ДК против клеток НЕр-2. С этой це-
лью была проведена серия экспериментов с предварительной часовой обработкой ЛПС-стимулированных IFN-ДК здоровых доноров растворимыми формами рецепторов к лиган-дам, относящимся к семейству фактора некроза опухоли (TNF). Предварительная обработка tnfri: Fc IFN-ДК приводила практически к полному блокированию цитотоксической активности против клеток опухолевой линии НЕр-2 (в среднем на 88% - с 26,88 ± 3,74% до 3,1 ± 2,59%), тогда как добавление растворимой формы TRAIL-R2: Fc и Fas: Fc не подавляло киллерную активность ДК. Таким образом, полученные данные подтверждают резистентность клеток HEp-2 к TRAIL и FasL-ме-диируемому апоптозу и свидетельствуют о том, что лизис клеток HEp-2 опосредуется с вовлечением TNFa/TNF-RI сигнального пути.
Поскольку IFN-ДК больных глиомами высокой степени злокачественности характеризуются выраженным снижением цитотокси-ческой активности против клеток НЕр-2 [5], можно сделать вывод о нарушении TNFa-ме-диируемого механизма цитотоксичности ДК у больных этой категории. Кроме того, учитывая тот факт, что супернатанты IFN-ДК не обладают киллерной активностью против клеток НЕр-2 [5], можно предположить, что цитоток-сичность IFN-ДК обусловлена трансмембранной формой TNFa, которая, согласно данным литературы, также может взаимодействовать с TNF-R1 [7].
На следующем этапе нами была проведена сравнительная оценка экспрессии трансмембранной формы TNFa на IFN-ДК здоровых доноров и больных глиобластомой. Популяция IFN-ДК доноров содержала в среднем TNFa -позитивных клеток 5,8 ± 0,2%. Для IFN-ДК больных этот показатель был достоверно ниже и составлял в среднем 3,7 ± 0,6% (pU<0,05). Характерно, что была отмечена корреляционная связь между низким уровнем экспрессии TNFa и уровнем цитотоксической активности ДК пациентов этой группы (R=0,759, p=0,029).
Исследование влияния иммуноактивного препарата на основе рекомбинантного ин-терлейкин-2 человека (р^-2) на цитотокси-ческую функцию ДК больных показало, что обработка IFN-ДК рГЬ-2 увеличивала исходно низкий уровень цитотоксической активности ДК против клеток HEp-2 практически у всех больных. Под действием рГЬ-2 отмечалось более чем трехкратное усиление цитотокси-
ческой активности 1Б^ДК (ри<0,05) больных против опухолевых клеток линии НЕр-2 по сравнению с интактными 1Б^ДК (26,57 ± 4,74% у$. 8,14 ± 2,39%, соответственно). При этом 1Ь2-модифицированные ДК больных глиобластомой характеризовались более высоким уровнем экспрессии TNFa по сравнению с интактными ДК пациентов этой категории (4,5 ± 0,5% У5. 3,7 ± 0,6%, соответственно; ри<0,05). Таким образом, можно заключить, что 1Ь-2 может регулировать цитотоксическую активность ДК через экспрессию мембранной формы TNFa.
На основе полученных результатов можно предположить, что после того, как 1Ь-2 про-контактирует с ДК через рецепторное взаимодействие, запускается каскад активационных путей, приводящих к функциональным перестройкам. Данные о влиянии 1Ь-2 на цитотоксическую функцию ДК отсутствуют. Однако, известно, что 1Ь-2 активирует NK-клетки и Т-лимфоциты, усиливая их пролиферацию, а также цитотоксическую активность [8]. Наблюдаемое нами повышение цитотоксической активности ИГ^ДК больных против TRAIL-резистентных клеток НЕр-2 после инкубации ДК с р^-2 позволило предположить, что ука-
занный препарат оказывает влияние на механизмы передачи сигналов в клетке, в частности, влияет на запуск сигнального пути, связанного с продукцией TNFa.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Banchereau J., Steinman R. M. Nature 1998, 392, 245-252.
2. Janjic B. M., Lu G., Pimenov A., et al. J. Immunol. 2002,168, 1823-1830.
3. Stary G., Bangert Ch., Tauber M., et al. JEM 2007, 204,6,1441-1451.
4. Тыринова Т. В., Леплина О. Ю., Тихонова М. А., Сахно Л. В., Останин А. А., Черных Е. Р. Медицинская Иммунология 2012, 14, 1-2, 43-50.
5. Леплина О.Ю., Тыринова Т. В., Ступак В. В., Ми-шинов С. В., Пендюрин И. В. и др. Российский иммунологический журнал 2011, 5 (14), 3-4, 322-332.
6. Мишинов С. В., Черных Е. Р., Леплина О. Ю., Ты-ринова Т. В., Тихонова М. А. и др. Российский нейрохирургический журнал 2011, III, спецвыпуск С.324-325.
7. Horiuchi T., Mitoma H., Harashima S., Tsuka-moto H., Shimoda T. Rheumatology 2010, 49, 7, 1215-1228.
8. Weil-Hillman G., Voss S. D., Fisch P., et al. Cancer Res. 1990, 50, 2683-2691.
TNFa-ASSOCIATED IMPAIRMENT OF CYTOTOXIC ACTIVITY OF DENDRITIC CELLS IN MALIGNANT BRAIN GLIOMA PATIENTS
Tyrinova T. V., Leplina O. Y., Mishinov S. V.1, Stupak V. V.1
Research of Clinic
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.