ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 9, с. 1075-1082
ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА
УДК 616-009.55
ТОЧКОВЫЕ МУТАЦИИ В ГЕНЕ SMN1 У БОЛЬНЫХ ПРОКСИМАЛЬНОЙ СПИНАЛЬНОЙ МЫШЕЧНОЙ АТРОФИЕЙ I-IV ТИПА, ИМЕЮЩИХ ОДНУ КОПИЮ ГЕНА SMN1
© 2015 г. В. В. Забненкова1, Е. Л. Дадали1, С. Б. Артемьева2, И. В. Шаркова1, Г. Е. Руденская1, А. В. Поляков1
Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва 115478 e-mail: V_Zabnenkova@dnalab.ru, apol@dnalab.ru 2Научно-исследовательский клинический институт педиатрии, Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва 125412 Поступила в редакцию 17.11.2014 г.
Проксимальная спинальная мышечная атрофия (СМА) I—IV типа — одно из наиболее распространенных аутосомно-рецессивных заболеваний, характеризующееся в большинстве случаев тяжелым инвалидизирующим течением. К возникновению проксимальной СМА приводят мутации в тело-мерной копии гена SMN — SMN1. Основным типом мутаций в этом гене являются делеции экзонов 7 и/или 8, которые в гомозиготном состоянии выявляются у 95% больных. В 5% случаев проксимальной СМА делеции указанных экзонов SMN1 обнаруживаются в компаунд-гетерозиготном состоянии в сочетании с внутригенными точковыми мутациями. В настоящей работе проведен анализ точковых мутаций у восьми пациентов с фенотипом проксимальной СМА I—III типа, имеющих де-лецию 7-8-го экзонов гена SMN1 в гетерозиготном состоянии. Выявлено семь различных мутаций, две из которых — c.824G>C (p.Gly275Ala) и c.835-2A>T описаны нами впервые. Кроме того, мутация c.824G>C (p.Gly275Ala) встретилась в анализируемой выборке дважды. В семи случаях гетерозиготным носителем точковых мутаций был один из родителей больных детей (в шести случаях — отец, в одном случае — мать). Лишь в одном случае мутация c.43C>T (p.Gln15X) возникла de novo в половой клетке отца ребенка.
DOI: 10.7868/S0016675815080123
Проксимальная спинальная мышечная атрофия (СМА) — одно из наиболее тяжелых нейро-мышечных заболеваний с аутосомно-рецессив-ным типом наследования. Частота носительства данного заболевания в России составляет 1 на 37 человек [1]. Клинические проявления заболевания характеризуются прогрессирующими симптомами вялого паралича с преимущественным поражением мышц тазового и плечевого поясов вследствие дегенерации а-мотонейронов передних рогов спинного мозга.
Выделяют четыре типа проксимальной СМА в зависимости от возраста начала, тяжести течения заболевания и продолжительности жизни больного [2].
СМА I типа, или болезнь Верднига-Гоффма-на, является наиболее тяжелым вариантом с ранним началом (до 6 мес.) и высокой летальностью в течение первых двух лет в результате развития аспирационной пневмонии.
СМА II типа имеет более позднее начало (6— 18 мес.) и менее тяжелое течение. Причиной смерти таких больных часто является дыхательная недостаточность в подростковом возрасте.
СМА III типа, более известная как болезнь Ку-гельберга—Веландер, имеет широкий диапазон возраста манифестации, который может варьировать от 18 мес. до второго десятилетия жизни, и относительно мягкую картину течения заболевания.
СМА IV типа в клинической картине имеет самый легкий двигательный дефицит, возникающий исподволь в третьей декаде жизни, и характеризуется медленно прогрессирующим течением с сохранением самостоятельной ходьбы даже в зрелом возрасте.
Эти типы СМА являются аллельными генетическими вариантами, развитие которых обусловлено мутациями в гене SMN, кодирующем белок выживаемости мотонейронов (survival motor neuron). Показано, что этот белок с молекулярной массой 38 кДа состоит из 294 аминокислот и играет существенную роль в важнейших клеточных процессах — биогенезе сплайсосомных малых ядерных рибонуклеопротеинов и сплайсинге пре-мРНК. Ген картирован на хромосоме 5 в ло-кусе 5q12.2-q13.3 и имеет центромерную и тело-мерную копии.
Ген SMN1 и его центромерная копия SMN2 демонстрируют беспрецедентный уровень гомоло-
гии. Они состоят из девяти экзонов (1, 2a, 2b, 3— 8) и различаются всего лишь пятью нуклеотида-ми. На уровне аминокислотного состава наблюдается полная гомология между центромерной и теломерной копиями гена SMN [3]. Вследствие различия в нуклеотидной последовательности основной транскрипт гена SMN1 является полноценным (full-length SMN, FL-SMN), в то время как транскрипт гена SMN2 не содержит экзона 7 (SMN Д7). Однако ген SMN2 также продуцирует FL-SMN транскрипт, но в относительно малых количествах. При исследовании больных СМА и моделей заболевания на животных отмечено, что продуцируемый геном SMN2 уровень полноразмерного белка SMN достаточен для нормального функционирования большинства клеток, но не двигательных нейронов передних рогов спинного мозга. Полагают, что в а-мотонейронах существует механизм, влияющий на включение экзона 7 в мРНК, что жестко ограничивает синтез необходимого количества FL-SMN белка с гена SMN2 [4].
Итак, молекулярно-генетической причиной проксимальных СМА I—IV типов являются мутации в теломерной копии гена SMN — SMN1.
Основной тип мутаций в гене SMN1 составляют делеции экзонов 7 и/или 8, которые выявляются у 95% больных. Остальные 5% больных представлены компаунд-гетерозиготами по деле-ции в одной копии гена SMN1 и точковой мутации в другой, крайне редко — компаунд-гетерози-готами по двум минорным мутациям.
Учитывая вышесказанное, пациентам, имеющим клинические признаки проксимальной СМА, в первую очередь следует проводить поиск делеции экзонов 7-8 гена SMN1. Наличие мажорной мутации у 95% больных, представляющей собой полную или частичную делецию гена SMN1, позволяет весьма эффективно диагностировать СМА в большинстве случаев. Выявление делеции экзонов 7-8 в гомозиготном состоянии позволяет подтвердить диагноз СМА у больного.
При отсутствии у больного делеции экзонов 7-8 гена SMN1 в гомозиготном состоянии следует провести количественный анализ числа копий генов SMN. На сегодняшний день оптимальным диагностическим методом для определения числа копий генов SMN является мультиплексная проба-зависимая лигазная реакция с последующей амплификацией (Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA).
При детекции количественным методом у больного СМА одной копии гена SMN1 и при уверенности врача в клиническом диагнозе такому пациенту необходимо провести поиск малых мутаций в гене SMN1 методом прямого автоматического секвенирования.
При выявлении у больного двух копий гена SMN1 или одной копии гена SMN1 в сочетании с отсутствием в ней точковой мутации следует пересмотреть возможный диагноз для данного пациента.
Цель работы — поиск минорных мутаций в гене SMN1 у пациентов с фенотипом проксимальной СМА, имеющих делецию экзонов 7-8 гена SMN1 в гетерозиготном состоянии, для совершенствования алгоритма молекулярно-генетиче-ской диагностики заболевания.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена на образцах ДНК группы больных СМА I—III типов, находящихся под наблюдением сотрудников научно-консультативного отдела МГНЦ РАМН и неврологического отделения НИКИ педиатрии РНИМУ им. Н.И. Пирогова.
Данная группа представлена восемью больными из неродственных семей в возрасте от одного месяца до 37 лет. Диагноз СМА устанавливался на основании наличия типичных клинических (прогрессирующий вялый паралич конечностей в сочетании с фасцикуляциями в зоне пораженных мышц) и электромиографических (наличие спонтанной переднероговой активности при проведении электромиографии (ЭМГ) с мышц верхних и нижних конечностей) данных, свидетельствующих о поражении мотонейронов спинного мозга.
Все пациенты не имеют делеции экзонов 7-8 гена SMN1 в гомозиготном состоянии.
Кровь у больных взята методом венозной пункции в одноразовые пластиковые пробирки с антикоагулянтом ЭДТА. Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови выполняли с помощью готового набора реактивов для выделения ДНК Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA) согласно протоколу фирмы-производителя.
Число копий генов SMN определяли методом мультиплексной проба-зависимой лигазной реакции с последующей амплификацией (Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA) [5].
Поиск мутаций в гене SMN осуществлялся методом прямого автоматического секвенирования по Сенгеру, как с прямого, так и с обратного прай-мера, на приборе ABI Prism 3130 (Applied Biosystems) с использованием протокола фирмы-производителя. В качестве матрицы для секвенирования использовали фрагменты ДНК, полученные после проведения ПЦР с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров, которые синтезировались в ЗАО "Евроген".
ПЦР проводили на программируемом термо-циклере МС2 (ДНК-Технология, Россия) в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 0.1—1 мкг ге-
Таблица 1. Последовательность праймеров и длина амплифицируемого фрагмента гена SMN
Ген SMN Последовательность Температура отжига, ^/количество циклов, n Длина фрагмента, пн
Экзон 1 5'—3' CAGTGAAATGAAAGGATTGAGAGA 5'—3' CTGAGAGCGCTAATAGGGAGAC 62/30 308
Экзон 2A 5'—3' GTGTGGATTAAGATGACTCTTGG 5'—3' CAATTCCTTTCCAAATGAATAACGAG 62/30 222
Экзон 2B 5'—3' TGCACCACCCTGTAACATGTAC 5'—3' CACTATTAAATAAGGACTAATGAGACATCC 62/30 226
Экзоны 3—4 5'—3' CAAATCTCTACCCTCTATCCTTCAC 5'—3' CAAATTAGTTAACAGAGAGGTTAAATGTCC 62/30 650
Экзон 5 5'—3' GGTTTTGAGTCCTTTTTATTCCTATC 5'—3' GTGAAAGCAAAATCTAACCTATACTC 62/30 217
Экзон 6 5'—3' GCATTCACTATATAATATAAATCTCCAGAC 5'—3' CAAAAAAATTGTCAGGAAAAGATGC 62/30 231
Экзон 7 5'—3' GTGAAACAAAATGCTTTTTAACATCC 5'—3' CCATAAAGTTTTACAAAAGTAAGATTCAC 62/30 206
Экзон 8 5'—3' GGTTTAACTGGAATTCGTCAAGC 5'—3' CAAATTTTCTCAACTGCCTCACC 62/30 383
номной ДНК, 1х реакционный буфер (67 мМ Tris-HCl, 16.6 мМ (NH4)2SO4, 0.01% Twin-20), 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1 мМ MgCl2, 1.5 единицы термофильной ДНК-полимеразы, 20—30 мкл минерального масла (табл. 1).
Результаты амплификации оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией в УФ-излуче-нии (длина волны 312 нм).
Анализ результатов секвенирования осуществлялся с помощью программ Chromas и BLAST (http:
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.