ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2008, № 4, с. 507-512
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 612.111:615.917
ТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ Ар25-35 И ФУЛЛЕРЕНА С60
НА ЭРИТРОЦИТЫ
© 2008 г. И. Н. Соломадин, Н. В. Маров, Н. И. Бенедиктова, Е. А. Косенко, Ю. Г. Каминский
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290 Московская обл., Пущино, Институтская ул., 3 E-mail: kaminsky@iteb.ru Поступила в редакцию 06.04.2007 г.
Методами световой микроскопии и спектрофотометрии показано, что амилоидный в-пептид Ав25-35 и водорастворимый фуллерен Сб0 вызывают лизис эритроцитов человека и крысы. Впервые установлено, что и фуллерен С60, и Ав25-35 снижают активность мембраносвязанной фосфофруктокиназы, а также цитоплазматической лактатдегидрогеназы в эритроцитах.
Амилоидные в-пептиды (Ав) - низкомолекулярные белки, структурные компоненты амилоидных отложений, известных как внеклеточные се-нильные бляшки, которые вызывают медленную дегенерацию нервных клеток в мозге при болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных расстройствах (Shoji et al., 1992; Robakis, 1994). Ae являются обычными растворимыми метаболитами (Haass et al., 1992; Shoji et al., 1992; Seubert et al., 1993), имеются в плазме крови и спинномозговой жидкости в равной концентрации у пациентов с болезнью Альцгеймера и здоровых лиц (Lewczuk et al, 2004).
Как растворимые, так и форменные элементы крови способны связывать Ав (Kuo et al., 2000). При инкубации с Ав25-35 эритроциты человека испытывают лизис (Mattson et al., 1997). Поскольку Ав25-35 есть в крови человека (Мягкова и др., 2001), его взаимодействие с эритроцитами может иметь диагностическое значение.
Потенциальными протекторами против клеточной токсичности Ав рассматриваются фулле-рены - наночастицы, многоуглеродные молекулы с уникальными физико-химическими свойствами (Huang et al, 2000; Kim, Lee, 2003; Podolski et al, 2007). Водорастворимый фуллерен С60 препятствовал образованию фибрилл из Ав25-35 в водном растворе (Kim, Lee, 2003) и улучшал память у животных, которым Ав25-35 был введен в мозг (Podolski et al., 2007). Для проверки гипотезы, согласно которой фуллерены могут защищать клетки от повреждающего действия Ав25-35, мы исследовали влияние водорастворимого фуллерена С60 на лизис эритроцитов человека и крысы, вызванный Ав25-35,
а также активность мембраносвязанных и цито-плазматических ферментов в эритроцитах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Свежую венозную кровь добровольцев или смешанную кровь крысы, отобранную при декапи-тации, использовали для получения суспензии очищенных эритроцитов (Kosenko et al., 1997). Кровь (0.25 мл) смешивали с 25 мкл 130 мМ цитрата натрия и центрифугировали 10 мин при 1000 g. Осадок клеток дважды промывали центрифугированием в среде, содержащей 10 мМ KH2PO4, рН 7.5; 3.5 мМ KCl; 1.5 мМ MgCl2; 145 мМ NaCl и 6 мМ глюкозу, при 1000 g в течение 10 мин и суспендировали в этой же среде в соотношении 1 : 5. Эритроциты хранили до 24 ч при 4°С.
Aß25_35 и Aß35_25 (Sigma, США) растворяли в воде до конечной концентрации 1 мг/мл и инкубировали в течение 2 ч при 37°С для образования молекулярных агрегатов. Об агрегации Aß25_35 судили по флуоресценции добавляемого в оптическую кювету тиофлавина Т при 482 нм (возбуждение при 3б0 нм) (Roher et al., 1986; ^минский и др., 2007). Использовали водорастворимый фуллерен С60 из источника и в форме, которые были описаны ранее (Podolski et al., 2007). Концентрация фуллерена С60 в 7 мкМ была выбрана в предварительных экспериментах как действующая на эритроциты, но она в 30 раз меньше той его концентрации в спинномозговой жидкости, которая препятствует ухудшению памяти у крыс, подвергнутых действию Aß25-35 (Po-dolski et al., 2007).
Лизис эритроцитов оценивали спектрофото-метрически. Клетки инкубировали в 0.9%-ном рас-
Рис. 1. Эритроциты человека до инкубации (а) и после инкубации (б) с 25 мкМ AP25-35• об. х60, ок. х20; общее ув. х2400.
Рис. 2. Лизис эритроцитов человека под действием AP25-35• Концентрация эритроцитов 15 х 107 кл./мл. 1 - АРз5_25; 2 -AP25-35• Каждый результат - среднее для трех измерений на одном и том же препарате эритроцитов (для рис. 2-5, 7-9). Ошибка измерения не превышает размера точки (для рис. 2-5).
творе в течение 4 ч при 25°С в отсутствие или в присутствии Ар25-35, Ав35-25 или фуллерена С60. Затем суспензию центрифугировали 10 мин при 1000 g и, как показатель лизиса эритроцитов, измеряли оптическую плотность супернатанта при 540 нм. Степень лизиса определяли в процентах. За 100%-ную степень лизиса принимали оптическую плотность супернатанта после инкубации клеток с 1 мМ додецилсульфатом натрия.
Функциональную активность эритроцитов и целостность их мембран оценивали по активности ферментов: цитоплазматической лактатдегидро-геназы (ЛДГ, КФ 1.1.1.27) и мембранной фосфоф-руктокиназы (ФФК, КФ 2.7.1.11). Из суспензии клеток отделяли нелизированные эритроциты центрифугированием при 1000 g в течение 10 мин, разрушали их 0.2%-ным сапонином и вновь центрифугировали при 14000 g в течение 20 мин. В су-пернатанте, представляющем цитоплазматиче-скую фракцию, определяли активность ЛДГ, а в осадке с мембранной фракцией - активность ФФК.
Активность ЛДГ измеряли спектрофотометри-чески при 340 нм по скорости окисления НАДН (Bergmeyer, Bemt, 1974). Реакционная смесь содержала 50 мМ фосфатный буфер, pH 7.4; 0.18 мМ НАДН и 10-50 мкг белка цитоплазматической фракции эритроцитов в конечном объеме 2.5 мл. Реакцию запускали добавлением 1 мМ пирувата натрия.
Активность ФФК измеряли спектрофотомет-рически при 340 нм по скорости окисления НАДН (Ш, Sumi, 1982). В 0.5 мл буферного раствора, содержащего 70 мМ трис-буфер, рН 8.5; 1.4 мМ
MgSO4; 4.5 мМ KCl; 0.7 мМ фосфоенолпируват натрия; 1 мМ АТФ; 10 мМ меркаптоэтаол; 0.18 мМ НАДН; 4 ед. пируваткиназы; 10 ед. ЛДГ и 10-50 мкл белка лизата или мембранной фракции эритроцитов. Реакцию запускали добавлением 9 мМ фрук-тозо-6-фосфата.
Морфологический анализ выполняли с помощью светового микроскопа Axiovert 200 ("Carl Zeiss", Германия) в отраженном свете и с устройством для цифровой регуляции (Digital Zoom) увеличения при постоянных объективе х60 и окуляре х20.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При световой микроскопии в суспензии эритроцитов человека после инкубации с Aß25-35 наблюдалось резкое увеличение количества клеток с нарушенной морфологией мембраны. Клетки теряли характерную для эритроцитов форму двояковогнутых дисков, приобретали поверхностные "шипы", в суспензии появлялись скопления слипшихся клеток (рис. 1). Точно такая же картина наблюдалась с эритроцитами крысы.
Инкубация эритроцитов с Aß25-35 приводила к лизису клеток. Степень лизиса эритроцитов зависела от концентрации Aß25-35, а также от концентрации эритроцитов и времени их инкубации с
Aß25-35.
На рис. 2 показана зависимость степени лизиса эритроцитов человека от концентрации Aß25-35. Видно, что зависимость имеет линейный характер.
ТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ Ар25-35 И ФУЛЛЕРЕНА С,
60
509
Степень лизиса эритроцитов, % 40
30 -
20 -
10 -
0 5 10 15 20 25 Концентрация АР25-35, мкМ
Рис. 3. Лизис эритроцитов крысы под действием АР25_35.
Степень лизиса эритроцитов, % 40
30
20
10
0
15
30
45
Концентрация эритроцитов, 10' кл./мл
Рис. 4. Лизис эритроцитов крысы под действием АР25_35 в зависимости от концентрации эритроцитов. По оси абсцисс - концентрация эритроцитов, инкубированных с 25 мкМ АР25-35.
Эритроциты крысы при тех же концентрациях Ар25-35 оказались примерно вдвое более резистентными (рис. 3).
Как показали полученные результаты (рис. 4), степень лизиса эритроцитов снижалась более чем в 2 раза при 3-кратном увеличении их концентрации. При увеличении времени инкубации до 2 ч степень лизиса эритроцитов резко возрастала и далее не изменялась (рис. 5).
При испытании фуллерена С60 как предполагаемого протектора от токсического действия АР25-35 выяснилось, что сам фуллерен С60 оказывает токсическое действие на эритроциты человека и крысы, усиливающееся в присутствии Ар25-35 (рис. 6). После инкубации с С60 в суспензии эритроцитов появляются шарообразные клетки с "шипами" (рис. 66). Инкубация эритроцитов при одновременном присутствии в среде АР25-35 и С60 приводит к их слипанию в многоклеточные агрегаты (рис. 6в).
Действие нетоксичного АР35-25 приводит к лизису незначительного числа эритроцитов (рис. 2, 7). Добавление в инкубационную среду фуллерена С60 или смеси АР25-35 с фуллереном приводило к практически одинаковому усилению лизиса эритроцитов. Сходно токсическое действие фуллерена С60 на эритроциты крысы.
Такой результат нов, но не является неожиданным. Недавно было показано, что фуллерен С60 токсичен для культур фибробластов кожи человека, клеток HepG2 карциномы печени человека, астроцитов человека (Sayes вг а1., 2005) и клеток глиомы крысы С6 (Isakovic вг а1., 2006). Таким образом, наши результаты подтверждают имеющиеся в литературе и дополняют их: фуллерен С60 ток-
сичен не только для клеточных культур, но и для эритроцитов человека и крысы.
После инкубации эритроцитов человека с 25 мкМ АР25-35 активность ЛДГ в цитоплазматиче-ской фракции гемолизата снижалась от 12.90 до 4.93 мкмоль/мин на 1 мл, тогда как 7 мкМ фуллерен С60 вызывал снижение активности фермента в меньшей степени - до 8.21 мкмоль/мин на 1 мл (рис. 8). Мы полагаем, что это связано с выходом части фермента из клеток в окружающую среду, поскольку активность ЛДГ в супернатанте, полученном после инкубации эритроцитов с АР25-35,
Степень лизиса эритроцитов, % 30
20
10
120 160 200 240 Время инкубации, мин
Рис. 5. Лизис эритроцитов человека под действием АР25-35 в зависимости от времени инкубации. Эритроциты в концентрации 30 х 107 кл./мл инкубировали с 5 мкМ АР25-35 в течение промежутка времени, указанного на оси абсцисс.
0
510
СОЛОМАДИН и др.
Рис. 6. Эритроциты человека до инкубации (а) и после инкубации с 7 мкМ Сбо (б) и 7 мкМ Сбо + 25 мкМ АР25_35 (в). Ув.: об. х60, ок. х20; общее ув. Х2400 (а, в) и Х1600 (б).
повышалась от 38 до 530 нмоль/мин на 1 мл. При одновременном присутствии в среде фуллерена С60 и АР25_35 активность ЛДГ снижалась до меньшего уровня, чем п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.