АГРОХИМИЯ, 2007, № 10, с. 62-66
Экотоксикология =
УДК 595.1423:632.122.2
ТОКСИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ КРАСНЫХ КАЛИФОРНИЙСКИХ ЧЕРВЕЙ И ИХ КОКОНОВ К НЕКОТОРЫМ НЕФТЕПРОДУКТАМ
И ИНГРЕДИЕНТАМ НЕФТИ*
© 2007 г. Е. В. Антонова, Д. И. Стом
Научно-исследовательский институт биологии при Иркутском государственном университете
664003 Иркутск, ул. Ленина, 3, а/я 24, Россия E-mail stomd@mail.ru; barhat@geogr.isu.ru. Поступила в редакцию 20.04.2007 г.
Рассмотрены некоторые аспекты возможного использования коконов дождевых червей для расселения вермикультуры в нефтезагрязненных почвах. Оценен способ определения степени жизнеспособности коконов по их дегидрогеназной активности. Проведен сравнительный анализ токсикоре-зистентности красных калифорнийских червей и их коконов к нефти, некоторым нефтепродуктам и их ингредиентам.
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что дождевые черви ускоряют очищение от нефтяного загрязнения и интенсифицируют процессы их ремедиации [1, 2]. При транспортировке вермикультуры для ее последующего расселения в загрязненных почвах более целесообразно применять не самих червей, а их яйцевые коконы [3]. Это дает ряд существенных преимуществ: не требует использования такого объемного и тяжелого субстрата, как влажная почва, существенно снижается занимаемый объем (длина взрослого червя 8-10 см, а кокона 3-5 мм), отпадает необходимость в периодических подкормках. Из одного кокона можно получить до 20 особей [4].
Целью исследований была сравнительная оценка устойчивости дождевых червей и их яйцевых коконов к нефти и нефтепродуктам. Основная задача состояла в разработке способа определения жизнеспособности коконов.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования были красные калифорнийские черви (Eisenia fetida andrei Bouche, 1963) и их яйцевые коконы. В лаборатории червей разводили в контейнерах при температуре 22-25°C и влажности 80-85%.
В экспериментах использовали нефть и нефтепродукты Марковского месторождения Иркутской обл.: летние автомобильные бензины марок 80 и 95 (ГОСТ 2084-77), летнее дизельное топливо (ГОСТ 305-82), флотский мазут Ф-5 (ГОСТ 10585-75), автол, авиационный бензин (Б-70),
* Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ и ГФЕНа 06-04-39003.
авиационный керосин (ТС-1), которые были получены в Ангарской нефтехимической компании. Кроме того, оценивали токсичность алифатических соединений: октана (С8Н18), нонана (С9Н20), декана (С10Н22), ундекана (С11Н24), додекана (С12Н26), гексадекана (С16Н34) и ароматических углеводородов: бензола (С6Н6), орто-, пара-, мета-ксилолов С6Н4(СН3)2, толуола (С7Н8), стирола (С8Н8), тетралина (С10Н12), декалина (С10Н18), нафталина (С10Н8), антрацена (С14Н10). Для приготовления эмульсий веществ их размешивали на магнитной мешалке в течение 40 мин.
Для дифференциации живых и мертвых коконов червей (мертвые коконы получали путем их термо-статирования в течение 2 ч при температуре 105°С) была проверена возможность использования дегидрогеназной активности. Для микроорганизмов период инкубации составил 55 мин в термостате при температуре 37°С и концентрации 2,3,5-трифенил-тетразолия хлористого (ТТХ) - 5 г/л [5, 6].
Для оценки жизнеспособности коконов червей в плотно закрывающиеся колбы наливали по 10 мл эмульсий исследуемых веществ, помещали по 10 яйцевых коконов червей в возрасте 5-15 сут (мо-лочно-желтых) и оставляли при комнатной температуре на 24 ч. После чего коконы переносили на 15-20 мин в дехлорированную водопроводную воду для удаления токсикантов с оболочки коконов. При определении жизнеспособности коконов по числу появившихся червячков коконы помещали в дерново-подзолистую почву при оптимальных влажности и температуре и подсчитывали количество червей через 30 сут. Оценку токсичности веществ для них проводили в чашках Петри диаметром 95 мм. В них наливали по 30 мл водных эмульсий нефтепродуктов различных концентра-
ТОКСИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ КРАСНЫХ КАЛИФОРНИЙСКИХ ЧЕРВЕЙ
63
ций и помещали по 4 особи одинакового размера (8-10 см). Основным критерием токсичности служила выживаемость червей спустя 24 ч.
Определяя возможность адаптации дождевых червей к нефти и некоторым нефтепродуктам, в загрязненную дерново-подзолистую почву (50 мл эмульсии 200 г почвы) помещали червей и инкубировали их в течении 30 сут при оптимальной температуре и влажности. По мере подсыхания субстратов добавляли эмульсии токсикантов. Всего за период исследования в среднем затрачено по 200 мл каждой эмульсии. Затем проводили токсикологическую оценку этих веществ, используя в качестве тест-объекта "обработанных" (находившихся в среде с нефтью и нефтепродуктами) и "необработанных" (находившихся в дерново-подзолистой почве без токсикантов - контроль) червей.
Для выявления способности коконов дождевых червей адаптироваться к нефти и некоторым нефтепродуктам в плотно закрывающиеся колбы наливали по 10 мл эмульсий исследуемых веществ различных концентраций. В них помещали по 10 яйцевых коконов червей в возрасте 5-15 сут и оставляли на 10 и 20 сут. Контроль - коконы, находившееся в дехлорированной водопроводной воде. Затем определяли жизнеспособность эмбрионов по дегидрогеназной активности их тканей.
Каждый опыт проводили не менее чем с тремя параллелями в 4-х биологических повторностях. Для статистической обработки применяли общепринятые методы с использованием пакета программ Statgraf 3.0 и Exsel 97. Выводы сделаны при вероятности безошибочного прогноза Р > 0.95.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Традиционно жизнеспособность коконов червей определяют по количеству вылупившихся из них червячков [4, 7]. Но данный метод очень длителен (не менее 1 мес.) и весьма трудоемок. Более того, из-за сложностей поддержания в течение долгого времени стабильными всех условий, требующихся для эмбриогенеза, возможна гибель зародышей. Последнее снижает объективность данного способа биотестирования. Поэтому для оценки физиологического состояния коконов червей необходимо иметь приемы, позволяющие получать результаты значительно быстрее.
Для дифференциации живых и мертвых коконов червей предприняли попытку использовать известный метод определения жизнеспособности яиц гельминтов путем окрашивания их раствором метиленового синего [8]. Согласно литературным данным, в этом случае мертвые яйца гельминтов окрашиваются сразу, а живые лишь через 15 мин. Но использование метиленового синего не позволило оценивать жизнеспособность яйцевых коконов дождевых червей. В условиях наших опытов в
синий цвет окрашивались практически сразу и живые, и мертвые коконы.
Определение жизнеспособности коконов червей по дегидрогеназной активности их тканей дало положительные результаты. Живые коконы после их инкубирования в растворе ТТХ приобретали красную окраску различной интенсивности, мертвые же коконы не окрашивались вовсе.
После подбора наиболее оптимальных параметров дегидрогеназной активности коконов червей рекомендованы следующие условия и манипуляции: в пробирки наливают по 5 мл воды дистиллированной и по 0.5 мл раствора ТТХ концентрацией 10 г/л. В каждую пробирку помещают по 10 коконов в возрасте 5-15 сут. Плотно закрытые пробирки оставляют в термостате на 55 мин при температуре 37°С. Результаты получают спустя 1-3 ч после инкубирования коконов в термостате, когда окраска становится более явной. О степени жизнеспособности коконов судят по интенсивности их окрашивания в красный цвет.
Правомочность предложенной реакции для оценки жизнеспособности коконов червей проверяли сопоставлением результатов токсикорези-стентности коконов к нефти и ряду нефтепродуктов по их дегидрогеназной активности и по количеству отрожденных червей (таблица).
Ранжируя нефтепродукты по их влиянию на дегидрогеназную активность коконов получили следующие последовательности: авиационный керосин (ТС-1) > дизельное топливо = бензин А-76 > бензин А-93 > авиационный бензин (Б-70) > > нефть > автол > мазут. По способности же снижать выход червячков испытанные нефтепродукты располагались в следующем порядке: авиационный керосин (ТС-1) > дизельное топливо > бензин А-76 > бензин А-93 > авиационный бензин (Б-70) > нефть > автол > мазут.
Сравнение полученных данных по окрашиванию коконов и количеству отрожденных червячков показало практически полное совпадение, за исключением незначительных отклонений, что свидетельствовало о приемлемости метода определения дегидрогеназной активности для оценки жизнеспособности коконов [9]. При этом важно подчеркнуть, что если при определении ферментативной активности коконов ответ получают через 1 ч, то по отрождению червей необходимо ждать почти 1 мес.
Сравнение токсикорезистентности красных калифорнийских червей и их коконов к нефти, ряду нефтепродуктов и их ингредиентов в серии токсикологических исследований (рис. 1) показало, что коконы были гораздо устойчивее червей ко всем используемым веществам, за исключением мазута, примерно в 2.5-5 раз, а в случае авиационного керосина (ТС-1) - в 20 раз.
Сравнение токсикорезистентности коконов красных калифорнийских червей к нефти и ряду нефтепродуктов, определенной по дегидрогеназной активности и отрождению червей из коконов
Концентрации веществ, мл/л
Вариант минимально действующие максимально недействующие
1 2 1 2
Нефть 31.0 ± 1.0 31.0 ± 0.7 4.8 ± 0.7 5.0 ± 0.5
Дизельное топливо 10.4 ± 0.5 10.0 ± 0.6 1.0 ± 0.2 0.8 ± 0.1
Бензин А-80 15.2 ± 0.5 10.4 ± 0.5 5.4 ± 0.5 3.7 ± 0.4
Бензин А-92 25.0 ± 1.0 23.8 ± 1.2 1.7 ± 0.2 1.2 ± 0.1
Авиац. бензин (Б-70) 31.0 ± 0.4 31.0 ± 1.0 9.6 ± 0.7 10.4 ± 0.7
Авиац. керосин (ТС-1) 5.2 ± 0.5 4.8 ± 0.4 0.6 ± 0.1 0.6 ± 0.1
Автол 52.0 ± 0.9 50.8 ± 1.2 10.2 ± 0.5 14.8 ± 0.4
Мазут 51.8 ± 1.3 50.8 ± 1.4 14.4 ± 0.7 11.0 ± 1.2
Примечания. 1. Минимально действующие концентрации веществ - после 24-ч экспозиции в эмульсиях токсикантов окрашивалось или отрождалось 0-20% коконов или червей соответственно; максимально недействующие - не менее 80% по сравнению с контролем (10 коконов - 100%; 25 червей - 100%). 2. В графе 1 - дегидрогеназная активность, 2 - отрождение червей.
На основании полученных материалов составили ряды токсичности исследуемых нефти и нефтепродуктов д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.