БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 2, с. 173 - 181
УДК 577.27
ТОКСИНСВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ ИЗ МЕМБРАН КИШЕЧНОГО ЭПИТЕЛИЯ ЛИЧИНОК Anopheles stephensi*
© 2006 г. М.А. Дронина1, Л.П. Ревина1, Л.И. Костина1, Л.А. Ганушкина2, И.А. Залунин1**, Г.Г. Честухина1
1 ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, 117545 Москва, 1-й Дорожный пр., 1; факс: (095)315-0501, электронная почта: zalunin@genetika.ru
2 Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского, Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, 119992 Москва, Большая Пироговская ул., 2, стр. 3
Поступила в редакцию 13.04.05 После доработки 17.06.05
Из апикальных мембран кишечного эпителия личинок комара Anopheles stephensi методом аффинной хроматографии выделены белки с молекулярной массой 65 и 57 кДа, способные специфически связываться с эндотоксином CryllA и активированным токсином Cry4B — Cry4B-tox, в условиях лиганд-блоттинга, причем оба Cry-белка конкурируют друг с другом за это связывание. По крайней мере в случае Cry4B-tox, связывание с 65 и 57 кДа белками обратимо. Способность продуктов ограниченного протеолиза эндотоксинов CryllA и Cry4B к связыванию с 65 и 57 кДа белками коррелирует с их активностью для личинок комаров. N-концевая аминокислотная последовательность 57 кДа белка уникальна и отсутствует в NCBI GenBank. По большинству изученных свойств 65 и 57 кДа белки сходны с токсинсвязывающими белками Aedes aegyp-ti и, возможно, образуют вместе с ними новый класс (классы) рецепторов S-эндотоксинов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: S-эндотоксины, Bacillus thuringiensis, токсинсвязывающие белки, Anopheles stephensi.
Энтомопатоген Bacillus thuringiensis (BT) продуцирует энтомоцидные белки, 8-эндотоксины, убивающие личинок многих видов насекомых, главным образом из отрядов Lepidoptera, Díptera и Coleoptera, а также нематод [1]. Энтомоцидные белки синтезируются в бактериальной клетке во время споруляции и образуют в ней крупные включения (кристаллы) [2]. К 8-эндо-токсинам принадлежат два класса белков: Cry- и Cyt-белки. В настоящее время известно около ста различных Cry-белков, имеющих однотипную вторичную и третичную структуру, но различающихся спектром чувствительных насекомых [3, 4]. Так, представители семейства Cryl токсичны для различных видов отряда Lepidoptera (лепидоцидные белки). Эндотоксины Cry4A, Cry4B и CryllA, а также белок CytA убивают личинок многих видов комаров (мос-китоцидные белки), эндотоксин Cry ЗА токсичен для личинок некоторых жуков [2, 5].
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 05-099, 23.10.2005.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
Большинство Cry-белков (например, эндотоксины CrylA, Cry4A, Cry4B) имеют молекулярную массу около 130—140 кДа и являются протоксинами, активация которых связана с деградацией С-концевой половины молекулы. При этом образуются активированные токсины с молекулярной массой 65—70 кДа [6]. В то же время, некоторые белки, например Cry3A и CryllA, изначально имеют молекулярную массу 65—70 кДа и соответствуют по пространственной структуре активированным токсинам высокомолекулярных Cry-белков [1]. Молекула активированных токсинов содержит в себе три домена, выполняющих различные функции [7, 8]. N-концевой домен ответствен за образование в мембранах пор или ионных каналов. Два других домена обеспечивают связывание со специфическим рецептором, встроенным в апикальную мембрану эпителиальных клеток. К настоящему времени описаны рецепторы ряда лепидоцид-ных токсинов из кишечника гусениц [1, 9—11]. В то же время очень мало известно о рецепторах москитоцидных токсинов у личинок комаров. Ранее нами из личинок комара Aedes aegypti были выделены белки, обладающие сродством к
москитоцидным белкам Cry4B и Сгу11А [12, 13]. Данная статья посвящена выделению токсин-связывающих белков из личинок Anopheles stephensi.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение 5-эндотоксинов. В работе использовали следующие штаммы B. thuringiensis: В-2395 (ssp. israelensis) и В-9032 (ssp. kurstaki) из коллекции ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва), а также штамм, принадлежащий к ssp. tenebrionis («Sandoz Crop Protection Corp.», США). Микроорганизмы выращивали на жидкой среде, содержавшей 1%-ный трипказин («Human», Венгрия), 0,2%-ный дрожжевой экстракт («Serva», Германия) и 0,6%-ную глюкозу, при 28° до полного лизиса спорангиев [14]. Кристаллы эндотоксина отделяли от других компонентов клеточного автолизата в двухфазной системе ксилол—вода [14].
Эндотоксины Cry4B, Cry11A и CytA выделяли из энтомоцидных кристаллов штамма В-2395. Для получения эндотоксинов Cry4B и CytA кристаллы обрабатывали 0,05 М натрий-карбонатным буфером, рН 10,5, содержавшим 0,01 М дитиотреитол («Serva») (буфер А), 1 ч при 20° и перемешивании. Смесь центрифугировали в течение 20 мин при 15 000 g на центрифуге Beckman J2-21 («GMI, Inc.», США). Полученный экстракт хроматографировали на колонке Mono Q («Amersham Biosciences», Швеция), уравновешенной с 0,05 М натрий-карбонатным буфером, рН 10,5, содержавшим 1 мМ дитиотре-итол. Элюцию осуществляли линейным градиентом концентрации NaCl (0—1 М) в том же буфере. Эндотоксины CytA и Cry4B элюировались с колонки при концентрации соли 0,1 и 0,4 М соответственно [15].
Для выделения эндотоксина Cry11A получившийся осадок экстрагировали 0,05 М №ОН в течение 30 мин при 20°, центрифугировали в течение 20 мин при 15 000 g и диализовали полученный экстракт против 0,05 М натрий-карбонатного буфера, рН 9,5 [16].
Эндотоксины, принадлежащие к Cry^-бел-кам, получали растворением кристаллов штамма В-9032 в буфере А в течение 1 ч при 37° и перемешивании с последующим диализом полученного раствора против 0,05 М Tris-НО-буфе-ра, рН 8,5.
Для получения эндотоксина Cry3A кристаллы ssp. tenebrionis растворяли в 0,1 М натрий-карбонатном буфере, рН 10,7 в течение 1 ч при 28° и перемешивании.
Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд [17].
Ограниченный протеолиз энтомоцидных белков. Перед проведением ограниченного протео-лиза все используемые энтомоцидные белки с помощью диализа переводили в 0,05 М Tris-HCl-буфер рН 8,6. Для получения фрагментов эндотоксина Cry4B с молекулярными массами 64, 50 и 48—49 кДа исходный белок обрабатывали соответственно химотрипсином («Serva»), трипсином («Serva») или кишечным соком личинок A. aegypti по методике, описанной ранее [12, 13]. Полученные гидролизаты далее в тексте обозначаются: Cry4B-tox, Cry4B-tr и Cry4B^a.
Протеолиз эндотоксина &у11А трипсином с образованием фрагментов 33 и 36 кДа (этот гид-ролизат далее обозначается Cry11A-tr) проводили в течение 2 ч при 37° и соотношении фермент : : субстрат (1 : 100, w/w).
Гидролизат Cry1A-tox получали обработкой смеси эндотоксинов Cry1A трипсином в соотношении 1 : 100. Протеолиз проводили в течение 12 ч при 37°.
Биотинилирование белков. Перед биотинили-рованием токсины и продукты их ограниченного протеолиза диализовали против 0,1 М карбонатного буфера, рН 9,5, содержавшего 0,15 М NaCl. Биотинилирование осуществляли с помощью N-сукцинимидного эфира биотина («Amersham Biosciences») по методике, описанной ранее [13].
Получение препаратов апикальных мембран (brush border membranes, BBM) кишечного эпителия личинок A. stephensi. Личинок выращивали в воде при 25°, используя для их питания смесь сухого корма KiteKat и витаминов [18]. Настоящие желудки (midguts) извлекали из насекомых, достигших третьей личиночной стадии, под би-нокуляром. Насекомых помещали на предметное стекло в каплю 17 мМ Tris-НО-буфера, рН 7,5, содержавшего 0,3 М маннитол («Sigma- Aldrich Corp.», США) и 5 мМ ЭГТА («Sigma-Aldrich Corp.») (буфер Б), вскрывали и вырезали часть пищеварительного тракта, соответствующую настоящему желудку. Извлеченный материал споласкивали буфером Б, содержащим 1%-ный (v/v) коктейль ингибиторов протеиназ для тканей млекопитающих («Sigma-Aldrich Corp.»), переносили в свежий объем того же буфера и хранили при —80°.
Перед получением BBM препараты кишечников размораживали и гомогенизировали в буфере Б, содержавшем коктейль ингибиторов протеиназ. Выделение BBM проводили методом, включавшим стадии осаждения мембран ионами магния и дифференциального центрифугирования, подробно описанным ранее [12,
19]. Сравнение удельной активности маркерного фермента (лейцинаминопептидазы) в исходном гомогенате и полученном препарате (в качестве субстрата использовали и-нитроанилид лейцина [12]) показало, что апикальные мембраны были очищены в 6 раз.
Синтез аффинных сорбентов. Аффинные сорбенты Cry11A- и Cry4B-сефароза синтезировали с использованием сефарозы 4В («Serva»), активированной бромцианом, по методике, описанной ранее [12]. Полученный препарат CryH^-сефарозы содержал 1,6 мг (22,9 нмолей) белка на 1 мл сорбента, а препарат Cry4B-сефарозы — 1,0 мг (15,4 нмолей) белка на 1 мл сорбента.
Изучение белкового состава экстрактов мембранных белков, полученных с помощью различных детергентов. Порции препарата BBM (4 мкл) смешивали с 0,1 мл 1%-ного раствора одного из следующих детергентов: NONIDET P40 («Amer-sham Biosciences»), «-октилгликозид («Boehringer Mannheim», Германия) и CHAPS («Sigma»), в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, содержавшем 1 мМ фенилметилсульфонилфторид («Sigma») и 1 мМ лейпептин («Sigma»), и инкубировали 30 мин на ледяной бане. Последующее центрифугирование проводили в течение 15 мин при 17 000 g и 4° на центрифуге 5417R («Eppendorf AG», Германия). Белковый состав полученных экстрактов определяли с помощью Ds-Na-ПААГ-электрофореза.
Аффинная хроматография экстракта мембранных белков A. stephensi. 0,14 мл препарата BBM смешивали с 2 мл 0,05 М натрий-карбонатного буфера, рН 9,5, содержавшего 0,05 М ЭДТА, 1%-ный ингибиторный коктейль и 1%-ный NON-IDET P40, и инкубировали, как описано выше. Экстракт наносили на колонки, содержавшие по 2 мл Оу11А- или Cry4В-сефарозы, уравновешенной с буфером В (0,05 М натрий-карбонатный буфер, рН 9,5, содержавший 0,2%-ный NONIDET P40 и 0,01 M ЭДТА), со скоростью 0,1 мл/мин. Хроматографию проводили методом,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.