МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 1, с. 29-39
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГЕНОМИКА. ^^^^^^ НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
УДК 577.212
ТОНКАЯ СТРУКТУРА, ЭКСПРЕССИЯ И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА РЕЦЕПТОРА ГОРМОНА РОСТА ЧЕЛОВЕКА
© 2004 г. И. В. Орловский, П. С. Свердлова, П. М. Рубцов*
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 119991
Поступила в редакцию 18.08.2003 г.
Ген рецептора гормона роста (РГР) человека служит примером сложной единицы транскрипции. Ген имеет протяженную 5'-регуляторную область, содержит множество 5'-нетранслируемых экзо-нов, которые в результаты альтернативного сплайсинга присоединяются к белоккодирующим эк-зонам. Транскрипция гена определяется несколькими промоторами, которые находятся на большом расстоянии от кодирующей области гена. В настоящее время известна полная нуклеотидная последовательность гена РГР человека. В обзоре суммированы результаты изучения структуры гена РГР человека и картирования альтернативных 5'-нетранслируемых экзонов гена. Приведены результаты анализа промоторной активности фрагментов гена в системе временной экспрессии ре-портерного гена, а также результаты изучения возможной регуляторной роли короткой открытой рамки считывания, расположенной в одном из 5'-нетранслируемых экзонов гена. Проведен поиск повторяющихся элеменов в гене РГР человека и охарактеризовано несколько полиморфных маркеров, которые могут быть использованы в изучении связи РГР с различными заболеваниями.
Ключевые слова: рецептор гормона роста человека, структура гена, экспрессия гена, альтернативные промоторы, альтернативный сплайсинг, короткая открытая рамка считывания, повторяющиеся элементы генома, делеционный полиморфизм, полиморфные микросателлиты.
Определение нуклеотидной последовательности генома человека, близкое к завершению, и сравнение ее со структурой геномов модельных организмов (дрожжи, нематода Caenorhabditis е1е-gans, дрозофила и другие) показало, что усложнение биологических систем в ходе эволюции определяется не столько увеличением числа генов у более высокоорганизованных организмов, сколько усложнением процессов регуляции экспрессии генов [1]. Это приводит к увеличению разнообразия на уровне транскриптома и протеома и сопровождается усложнением регуляторных связей и функциональных взаимодействий на клеточном и более высоких уровнях организации биологических систем. В настоящее время известно, что для экспрессии многих генов эукариот характерно образование нескольких или многих первичных транскриптов и последующее их превращение во множество альтернативных изоформ мРНК. Ген рецептора гормона роста (РГР) человека является ярким примером сложной единицы транскрипции. В особенностях регуляции его экспрессии проявляются сложность и многообразие механизмов реализации генетической информации. В настоящем обзоре суммированы результаты изучения структурно-функциональной организации гена РГР человека в рамках программы "Геном человека", основателем и руководителем кото-
* Эл. почта: rubtsov@eimb.ru
рой был выдающийся ученый и организатор науки академик Александр Александрович Баев. Собственные результаты авторов дополнены данными литературы о структуре и экспрессии генов РГР человека и других млекопитающих, полученными независимо в других лабораториях.
Изучение структуры и регуляции экспрессии гена РГР человека начато на рубеже 80-х и 90-х годов в Отделе генетической инженерии Института молекулярной биологии им. В.А. Энгель-гардта РАН, руководителем которого был Александр Александрович Баев. Интерес к изучению структуры и экспрессии гена РГР возник как следствие предшествующего цикла работ лаборатории по клонированию и экспрессии генов гормона роста человека и других полипептидных гормонов [2].
РГР является членом суперсемейства рецепторов, содержащих один трансмембранный домен. Это суперсемейство включает в себя также рецепторы пролактина, гемопоэтина, эритропоэтина, тромбопоэтина, гранулоцитарного колоние-стиму-лирующего фактора, интерферонов и многих ин-терлейкинов [3]. Ген РГР человека расположен в области р12 хромосомы 5 [4-6]. Одна из особенностей структуры этого гена - большая протяженность и сложная организация его 5'-регуляторной области. Ген содержит альтернативные 5'-нетранслируемые экзоны [7], которые транскрибируются с нескольких промоторов, функци-
Таблица 1. Схема организации гена РГР человека
Экзоны Положение экзонов относительно участка инициации трансляции (п.н.)* Номер депонированной нуклеотидной последовательности и/или ^ылка
Альтернативные 5'-нетранслируемые экзоны (экзон 1)
V2(1B) -142364/-141920 Z11801, S97393 [7, 10]
V9b -141423/-141277 AF230800, [11]
V9a -141398/-141277, -51795/-51511 AF230801, [11]
V3 -140883/-140837, -82638/-82546 Z11851, [7]
V10 -80168/-80042 AY216680
V7 -17832/-17724 Z11853, [7]
V1(1A) -17762/-17346 Z11802, [7]
V4 -16319/-16178 Z11849, [7]
V8 -15795/-15759 Z11848, [7]
V5** -414/-12 Z11850, [7]
Кодирующие экзоны
экзон 2 -11/+80 X06562, [12]
экзон 3 +63163/+63228 X06562, [12]
экзон 4 + 123015/+123144 X06562, [12]
экзон 5 +129042/+129914 X06562, [12]
экзон 6 + 133949/+134127 X06562, [12]
экзон 7 + 145332/+145 497 X06562, [12]
экзон 8 +147554/+147644 X06562, [12]
экзон 9 + 152177/+152246 X0656, [12]
экзон 10 + 152578/+156002 X06562, [12]
* Левые границы альтернативных 5'-нетранслируемых экзонов, приведенные в таблице, соответствуют 5'-концам наиболее длинных продуктов 5'-ЯАСЕ и, как правило, не совпадают с истинными точками инициации транскрипции (смещены в 3'-на-правлении).
** Экзон V5 расположен непосредственно перед экзоном 2. Он может представлять собой как часть неудаленного интрона (retained intron), так и альтернативный экзон, 5'-концевая часть которого до положения -11 удаляется при сплайсинге некоторых первичных транскриптов.
онирующих в разных тканях и типах клеток и на разных стадиях развития организма. В ходе транскрипции и последующего сплайсинга пре-мРНК образуются множественные формы мРНК, кодирующие полноразмерные мембранные РГР и укороченные с С-конца растворимые гормон-свя-зывающие белки. Мутации в гене РГР приводят к возникновению резистентности к гормону роста (синдром Ларона).
Организация и транскрипционная карта гена РГР человека
В ходе изучения структуры гена РГР человека нами клонированы и секвенированы фрагменты, содержащие большинство обнаруженых ранее 5'-нетранслируемых экзонов [7]. Геномные фрагменты выделены из клонов в ВАС- и ^-векторах или прямо амплифицированы из тотальной геномной ДНК [8, 9]. Нуклеотидные последова-
тельности фрагментов гена РГР человека депонированы в банке нуклеотидных последовательностей EMBL (Acc. numbers: AJ002175, AJ002739, AJ131868, AJ295613, AJ278681). В 2002 г. опубликована полная нуклеотидная последовательность сегмента хромосомы 5, перекрывающего ген РГР (NCBI GenBank, Acc. numbers: AC116343, AC093225, AC114941, AC113368, AC093260, AC008945). Это позволило создать более точную схему организации гена РГР человека. В размещенной на сервере UCSC [6] рабочей версии нуклеотидной последовательности генома человека ген РГР находится в участке хромосомы 5 с координатами 42423000-42723000, занимая примерно 300 т.п.н. Точное положение экзонов гена относительно точки инициации трансляции, расположенной в экзоне 2, представлено в табл. 1.
Как видно из таблицы, более 140 из 300 т.п.н., занимаемых геном РГР, приходится на 5'-некоди-
рующую область. Здесь картированы 7 из 8 идентифицированных нами ранее с помощью метода 5'-RACE 5'-нетранслируемых экзонов - V1-V5, V7 и V8 [7], а также обнаруженные позднее экзо-ны V9a, V9b (Acc. numbers: AF230800, AF230801) [11] и V10 (AY216680). Один из потенциальных экзонов, V6, как выяснилось, соответствует участку хромосомы 11 человека. Эти данные подтверждены нами с помощью ПЦР при исследовании ДНК соматических гибридных клеток человек х грызун, полученных в лаборатории Е.Д. Свердлова (ИБХ РАН) [13]. Ранее сообщалось о картировании альтернативного экзона V6 с помощью ПЦР на геномной ДНК в участке между экзонами V3 и V7 [11], однако наши попытки воспроизвести эти результаты оказались безуспешными. Мы полагаем, что образование фрагментов, в которых нук-леотидная последовательность V6 соединена со 2-м экзоном гена РГР, является или артефактом 5'-RACE, или результатом транс-сплайсинга.
Большая часть 5'-нетранслируемых экзонов образует два основных кластера - дистальный, содержащий экзоны V2, V9, V3, и проксимальный, включающий экзоны V7, V1, V4 и V8. Кодирующая область гена, начиная с содержащего инициирующий кодон экзона 2, занимает почти 160 т.п.н. Таким образом, оказалось, что ген РГР человека имеет значительно большие размеры, чем это представлялось ранее [12]. Полноразмерная мембранная форма рецептора имеет длину 620 аминокислотных остатков. Экзон 2 кодирует сигнальный пептид длиной 18 аминокислот, экзо-ны 3-7 - внеклеточный домен рецептора из 246 аминокислот, экзон 8 - трансмембранный сегмент из 24 аминокислот, экзоны 9 и 10 - цитоплазмати-ческий домен рецептора длиной 350 аминокислот, отвечающий за внутриклеточное проведение сигнала [12]. Наряду с мембранной формой рецептора обнаружены и укороченные с С-конца варианты, которые образуются как в результате ограниченного протеолиза, так и в результате альтернативного сплайсинга экзона 9 [14, 15].
Возвращаясь к структуре гена РГР, следует подчеркнуть, что особый интерес вызывает наличие области, удаленной более чем на 140 т.п.н. от 1-го кодирующего экзона и содержащей 5'-не-транслируемые экзоны. Эти экзоны, как впервые установлено нами [7], а затем подтверждено в других лабораториях [16, 17], в результате сплайсинга присоединяются к экзону 2. Для мРНК, содержащих экзоны этой области - V2, V3 и V9, характерна широкая тканевая специфичность экспрессии, они содержатся как в фетальных, так и во взрослых тканях [11]. Сходная организация 5'-области свойственна и генам РГР других млекопитающих [11]. Проксимальный кластер 5'-не-транслируемых экзонов расположен на расстоянии от -17.8 до -15.8 т.п.н. перед экзоном 2.
В этом участке расположен экзон V
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.